Хенке_Жидкостная хроматография [2009]

5.4. Колоночно жидкостный хроматографический анализ готовых препараций... 141

как такие смеси разделяются, идентифицируются и определяются количествен но. Для разделений в основном используется колоночно жидкостная хромато графия (КЖХ). Перед разделением, как уже упоминалось, снимается 1Н ЯМР

спектр смеси, а затем также каждого из отделенных пиков. Рисунки 5.9–5.18 по казывают разделения различных элюатов метанола, полярных компонентов пря

дильных препараций.

ПРИМЕР № 1 (см. рис. 5.9 и 5.10)

Согласно 1Н ЯМР и ИК спектрам выявлен продукт присоединения этиленоксида кислоты жирного ряда (полигликоль кислоты жирного ряда). Продукты присоеди нения ЭО (этиленоксида) кислоты жирного ряда состоят, как правило, из 3 компо нентов:

•сложный диэфир полиэтиленгликоля (ПЭГ),

•сложный моноэфир ПЭГ,

•несвязанный ПЭГ.

Несвязанный ПЭГ находят в разных этоксилатах в различных количествах. Сложный эфир полигликоля кислоты жирного ряда может быть количественно разделен, как следует из дальнейшего, и точно проанализирован.

•Если смесь ПЭГ 200 или 400 представляет собой сложный ди или моно эфир со свободным ПЭГ, то 3 компонента могут быть разделены ацетоном

количественно () на 5 метровом стандартном наборе колонок. ПЭГ мож но идентифицировать на основе ВЭЖХ как ПЭГ 200 или 400. Количествен ная оценка же производится путем взвешивания остатков элюата. Грави метрически определенные количества сложных ди и моноэфиров будут разделятся после метанолиза на 6 Lobar® ОФ С 8 колонках. Метанолизат состоит из несвязанного ПЭГ и сложных метиловых эфиров кислот жир ного ряда.

•У высших сложных эфиров полигликоля (ПЭГ ≥ 600) на стеклянных гото вых колонках Lobar® LiChroprep RP С 8 вначале отделяют свободный ПЭГ

от сложных ди и моноэфиров (1), чтобы затем полученную смесь переэте

рифицировать метанолом. Смесь можно разделить без концентрирования метанолизата непосредственно на 6 Lobar® RP С 8 колонках метанолом. Выделенный в несвязанном виде ПЭГ выходит перед количественно разде ленными сложными метиловыми эфирами кислот жирного ряда. ПЭГ, как и ранее, идентифицируется по сравнению со стандартами с помощью ВЭЖХ на ОФ С 8 сорбенте смесью метанола и воды.

Схема анализа для примера № 1 обобщенно представлена на рис. 5.9. С помо

щью ацетона осуществляется разделение продуктов присоединения ЭО по возра

стающей полярности.

Окончательная идентификация смеси была проведена после метанолиза пи

ков 1 и 2 и разделения ацетоном, а пика 3 непосредственно с помощью аналити ческой ВЭЖХ на ОФ С 8 сорбенте. Результат анализа выглядит так:

5.4. Колоночно жидкостный хроматографический анализ готовых препараций... 143

На 6 Lobar®>RP С>8 метанолом разделяют свободный ПЭГ и оба метиловых сложных эфира кислоты жирного ряда, C12:0/C14:0 в препаративных количествах. В первую очередь,

чтобы выделить свободный ПЭГ для идентификации.

С помощью ВЭЖХ

ПЭГ

МЭ:

ч

Рис. 5.10. Разделение различных элюатов метанола, полярных компонентов пря дильных препараций

1 = ПЭГ 400 – cложный диэфир кислоты кокосового масла

2 = ПЭГ 400 – cложный моноэфир кислоты кокосового масла 3 = ПЭГ 400

Кислота кокосового масла это обозначение смеси лаурин миристиновая кис

лота (соотношение примерно 3 : 1), главных компонентов кокосового масла, с изменяющимися, но незначительными количествами октановой, декановой, паль митиновой и олеиновой кислоты.

ПРИМЕР № 2 (см. рис. 5.11)

1Н ЯМР спектр дает нам следующую информацию о качественном составе по лярной смеси: продукт присоединения ЭО жирной кислоты и спирта жирного ряда.

Такие смеси, состоящие из сложных эфиров полигликоля кислоты жирного ряда и полигликолей спирта жирного ряда, являются комбинациями эмульгато

ров, входящих в состав препараций синтетического волокна.

И в этом случае можно, как это было в примере № 1, отделить количествен

но несвязанный ПЭГ, если есть в наличии или представляет интерес, от этокси латов на 6 Lobar® RP С 8 колонках. Такие смеси невозможно разделить на Се

фадекс LH 20 или других наполнителях колонок, потому что этоксилаты, как

правило, представлены в широком распределении, и они ведут к перекрыванию.

5.4. Колоночно жидкостный хроматографический анализ готовых препараций... 145

Было бы вполне возможно достичь с помощью ацетона частичного успеха на декстрановом геле. Сложные диэфиры элюировали бы из смеси, состоящей из сложных моноэфиров и продукта присоединения ЭО спирта жирного ряда. Вся

смесь сравнима с этоксилатами в примере № 3, так как алкилфенольный поли

гликоль по полярности (концевая группа ОН) можно отождествлять со сложны ми моноэфирами. В данном случае вся смесь была переэтерифицирована мета нолом и разделена на колонках Lobar® RP С 8 метанолом. Пик 1 (260 мг) – это выделенный из сложных ди и моноэфиров в несвязанном виде ПЭГ, согласно

спектру ВЭЖХ – это ПЭГ 600, а пик 2 это неизмененный полигликоль спирта

жирного ряда (372 мг). Пики 3 и 4 это сложные метиловые эфиры пальмитиновой

и стеариновой кислот (231 и 286 мг). Продукт присоединения ЭО спирта жирного ряда мог быть идентифицирован с помощью 1Н ЯМР спектра.

Средняя степень этоксилирования составляет 5, и алкильная цепь в среднем соответствует цепи спирта кокосового масла, т. е. смеси C12:0/C14:0. Весь процесс разделения и хроматографические условия представлены на рис. 5.11.

В соответствии с этим ходом анализа можно сделать следующие количествен ные и качественные оценки.

•Выделение (препаративное), количественная оценка (гравиметрическая) и идентификакция (с помощью ВЭЖХ), выделенного в несвязанном виде ПЭГ: пик 1.

•Выделение (препаративное), количественная оценка (гравиметрическая) и идентификация (1Н ЯМР спектры, а также определение общего ЭО по мето

ду расщепления HJ) продукта присоединения ЭО спирта жирного ряда: пик 2.

•Выделение (препаративное), количественная оценка (гравиметрическая или

с помощью ВЭЖХ) и идентификация (tR из ВЭЖХ) сложного метилового

эфира кислоты жирного ряда: пик 3 и 4.

ПРИМЕР № 3 (см. рис. 5.12 и 5.13)

Согласно 1Н ЯМР спектру и ИК спектру здесь представлена смесь из сложных эфиров полигликоля кислоты жирного ряда и алкилфенольных полигликолей.

И в этом случае есть 2 возможности, чтобы количественно разделить и опреде лить смесь продуктов присоединения этиленоксида. Как уже сообщалось, сво бодный ПЭГ может быть отделен заранее.

•Если смесь состоит из сложных ди и моноэфиров ПЭГ 200 или ПЭГ 400 а также алкилфенольного полигликоля, то 3 компонента могут быть разде

лены количественно сначала на Сефадексе LH 20 ацетоном, а затем после

метанолиза на колонках Lobar® RP С 8 метанолом. Сложные диэфиры ПЭГ 200 или 400 появляются на декстрановом геле перед неразделенной смесью, состоящей из соответствующих сложных моноэфиров и алкилфе нольного полигликоля. Весь ход разделения и химические формулы ком понентов представлены на рис. 5.12. Соответствующее этому описанию раз деление изображено на рис. 5.13. Препаративное гель хроматографическое

разделение исходной пробы можно видеть вверху слева (а), а пробы сво бодной от ПЭГ справа рядом (б). Разделение метанолизатов пиков 1 и 2

изображают хроматограммы на тех же рисунках слева и справа внизу.

146 Глава 5. Препаративное разделение сложных смесей веществ

Метанолэлюат По 1Н"ЯМР"спектру:

Продукты присоединения ЭО кислот(ы) и спирта жирного ряда.

свободный ПЭГ? *

Сложный диэфир

Сложный моноэфир

Алкилфенольный продукт присоединения ЭО

Выделение несвязанного ПЭГ на:

1.1 Lobar®>RP С>8 c помощью CH3OH/H2O 85 : 15

2.6 Lobar®>RP С>8 метанолом

Разделить на 5>м колонке

с Сефадексом>LH>20 в ацетоне

См. рис. 5.13а

См. рис. 5.13б

Метанолиз

Пик

См. рис. 5.13в и г

Пик

6 Lobar®>RP С>8 метанолом

Рис. 5.12. Разделение различных элюатов метанола, полярных компонентов пря дильных препараций

•Если имеются сложные ди и моноэфиры кислот жирного ряда полиэтиленг

ликоля (ПЭГ 600 или 1000), то они не могут быть отделены друг от друга или от продукта присоединения ЭО алкилфенола ацетоном на Сефадексе LH 20, как до этого было с низкоэтоксилированными кислотами жирного ряда. В таких случаях может помочь только метанолиз. Если необходимо или желательно, то

несвязанный или несвязанные ПЭГ отделяются от обоих этоксилатов и затем

переэтерифицируются метанолом. Метанолизат содержит ПЭГ, выделенный в несвязанном виде из сложных ди и моноэфиров, алкилфенольный полигли коль, а также сложный метиловый эфир кислоты жирного ряда. В этой после

5.4. Колоночно жидкостный хроматографический анализ готовых препараций... 149

ПРИМЕР № 5 (см. рис. 5.15 и 5.16)

1Н ЯМР спектр дал следующий общий результат: сложный эфир полигликоля

кислоты жирного ряда, ненасыщенная (–СН=СН–) алкильная цепь и соедине ния кислот жирного ряда, содержащие амидные связи. И в этом случае нам помо гает разделение на Сефадексе LH 20 метанолом. Схема разделения и само разде ление обобщенно представлены на рис. 5.15 и 5.16. Гель хроматографическое пре паративное разделение было проведено при следующих условиях.

На основании 1Н ЯМР спектров три пика могут быть отнесены к следующим химико молекулярным структурам.

•Пик 1, 323 мг Это сложный эфир полигликоля кислоты жирного ряда с ненасыщенной

алкильной цепью, возможно, олеиновая кислота. Этерифицированный ПЭГ предположительно имеет MМ > 4000.

•Пик 2, 2,56 мг Это производное диэтаноламида кислоты жирного ряда, этерифицирован

ные соединения 2 гидроксиэтила.

•Пик 3, 944 мг

Это главный компонент элюата метанола, диэтаноламид кислоты жирного ряда.

Гравиметрическая оценка препаративного разделения дала качественный со

став полярной смеси.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИКОВ

Как уже упоминалось, большинство компонентов прядильной препарации явля ются техническими продуктами, т. е. не чистыми веществами, как довольно часто следует из данных изготовителя. Это высказывание подтверждается посредством ВЭЖХ разделения (см. рис 5.16) пика 3 на рис. 5.15.

Ïèê 1

Смесь сложного эфира полигликоля кислоты жирного ряда была переэтерифи цирована метанолом и метанолизат напрямую, т. е. без увеличения концентра ции, разделяется количественно метанолом в препаративных количествах на 6 го

товых стеклянных колонках Lobar® LiChroprep RP С 8 (размер В). Пик 1 этого

разделения (см. рис. 5.15, слева внизу) был затем идентифицирован как ПЭГ 600 с помощью аналитической ВЭЖХ. Поэтому разделение сложных диэфиров от моноэфиров на Сефадексе LH 20 ацетоном было бы невозможно. Более поздние анализы посредством 13С ЯМР спектров и FD/масс cпектрометрии дали следу ющий результат: пик 1 – это этоксилированный 1,4 бутандиол с MМ, почти иден тичной ПЭГ 600. Разница в том, что этоксилированный диол на 1 атом кислоро

да «больше». Наряду с очень большим количеством сложного метилового эфира

олеиновой кислоты были представлены в небольших количествах лауриновая, ми

ристиновая и стеариновая кислоты в качестве сложного метиловог эфира. Таким образом пик 1 по результатам препаративного гель хроматографического разде

ления, по всей вероятности, является смесью этоксилированного 1,4 бутандиола в виде ди и моноолеата или неэтерифицированного этоксилата.

150 Глава 5. Препаративное разделение сложных смесей веществ

Элюат метанола Согласно 1Н"ЯМР"спектру:

продукт присоединения этиленоксида кислот жирного ряда, соединение с амидными группами и ненасыщенная алкильная цепь

На 5>м колонке Сефадекс LH>20 метанолом

Этоксилированный 1,4>бутандиолдиолеат Этоксилированный 1,4>бутандиолмоноолеат Этоксилированный 1,4>бутандиол

Смесь диэтаноламида из:

и

ч

ПЭГ 600

Колонка: 5>м Сефадекс LH>20: метанол

Величина пробы: 1323 мг элюата метанола, растворенное примерно в 40 мл элюента

Детектор: дифференциальный рефрактометр

Рис. 5.15. Разделение различных элюатов метанола, полярных компонентов пря дильных препараций

Ïèê 2

Если бы даже было только 56 мг побочного компонента элюата, его можно было

бы идентифицировать с помощью 1Н ЯМР анализа как производное диэтанол амида кислоты жирного ряда и записать, как и в схеме разделения, в виде следую

щей химической структурной формулы: