Хенке_Жидкостная хроматография [2009]

4.6. Жидкостно хроматографическое разделение лекарственного сырья 121

моноэфир гидрохинона, а из арбутина гидрохинон. На пластине силикагель GF254 cмесь можно разделить только ступенчатой техникой и многократным проявле нием следующим образом:

•растворитель (элюент) 1 этилацетат/метанол/вода 77 : 13 : 10, 2 × 5 см, затем

•растворитель (элюент) 2 хлороформ/вода 95 : 5, 1 × 10 см соответственно с промежуточной 5 минут

ной сушкой на воздухе.

Эта система разделения совершенно не годится для переноса на препара тивную силикагелевую колонку. В основном такие препаративные разделения проводят на Сефадексе LH 20 ацетоном или метанолом в качестве подвиж ных фаз.

Формулы:

I = Арбутин R = H

II = Метиларбутин R = СН3

ПРИМЕР 5

Лекарственное сырье кадинен, кадинол, кубелин и пиперин, которое содержится в черном и белом перце, а также в кубебене (черешчатый перец), можно разде лить и доказать с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле GF254 бензолом/этилацетатом 70 : 30 в виде порошкообразного экстракта лекарствен ного сырья. Этой смесью растворителя, но только 3…4 части объема этилацета

та в бензоле можно провести разделение в препаративных количествах на сили кагелевой колонке в названной последовательности. Это значит, что вещество будет элюировать с наибольшим Rf значением (кадинен) в качестве первого пика, а наиболее запаздывающее соединение (пиперин) появится в качестве после днего пика.

На Сефадексе LH 20 также возможны препаративные разделения с помощью

среднеполярных растворителей, таких как дихлорметан, этилацетат или ацетон в

качестве элюентов. Наилучшую информацию для этого дают разделения чисты ми растворителями на силикагелевой пластине. Последовательность элюирова ния на декстрангеле могла бы быть такова: пиперин перед кубелином перед кади неном перед кадинолом.

122 Глава 4. Примеры разделения из практики

ПРИМЕР 6

Производные антрахинона хризофановая кислота (I), 4,5 диоксиантрахинон 2 карбоновая кислота (II), франгула (реум )эмодин (III), алоэ эмодин (IV) и про

изводное антрона алоин (V) cодержатся в различных растениях, таких как, на пример, алоэ, кора крушины, ревень, и в листьях сенны.

Разделение тонкослойной хроматографией этих производных антрацена не простое, потому что в зависимости от состава должно проводиться ступенчатое проявление 2 разными элюентами:

•1 я ступень 5 см с помощью этилацетата/метанола/воды 77 : 13 : 10

•2 я ступень

После 10 минутной промежуточной сушки 10 см с помощью бензела/слож ного этилового эфира муравьиной кислоты, муравьиной кислоты 75 : 24 : 1.

4.7. Сефадекс LH 20 в сравнении с ВЭЖХ и ГПХ 123

На основании разницы в полярности, пусть даже незначительной, можно раз делить 4 агликона и гликозид на Сефадексе LH 20 c помощью метанола, ацетона или дихлорметана. Соединения, полученные в результате разделения метанолом,

элюируют в следующем порядке: 1 й – алоин, 2 й – алоэ эмодин, 3 я – 4, 5 ди оксиантрахинон 2 карбоновая кислота, 4 я – кризофановая кислота, 5 й – фран

гула эмодин.

При разделении ацетоном последовательность элюирования выглядит так: 1 я – кризофановая кислота, 2 й – франгула эмодин, 3 й – алоэ эмодин, 4 я – 4,5 ди оксиантрахинон 2 карбоновая кислота, 5 й – алоин.

4.7.Сефадекс LH 20 в сравнении

с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ)

и гель проникающей хроматографией (ГПХ)

Низкомолекулярные органические соединения (молярная масса < 1000) будут разделяться на Сефадексе LH 20 не только по уменьшающейся величине моле кул. Большее значение имеют адсорбционно хроматографические разделения. Это не преувеличенное утверждение относительно того, что ни у одной хрома

тографической системы разделения не существует так много связей и соответ ствий между химико молекулярной структурой разделяемых соединений и их удерживающими свойствами, как это можно наблюдать при разделении на Се фадексе LH 20 чистым растворителем в качестве подвижной фазы. В табл. 4.4 схематично сравниваются механизмы разделения ВЭЖХ, ГПХ и с помощью Сефадекс LH 20. Идея этого сравнения возникла после просмотра публикации

о связи ВЭЖХ и ГПХ [4.11].

То, что на гидроксипропилированном декстрангеле можно проводить разде ления молекулярно ситовой хроматографией и адсорбционной хроматографией

чистым растворителем в качестве подвижной фазы, было нам известно уже много лет назад из повседневной практики. Не составляет труда признать, что Сефадекс LH 20 объединяет механизмы разделения с помощью ВЭЖХ и ГПХ. Другими сло вами, чистыми растворителями на гидроксипропилированном декстрангеле мож но проводить оба вида разделения, т. е. Сефадекс LH 20 является универсальным наполнителем колонок. В ВЭЖХ, независимо от того, происходит разделение на

силикагеле или на поверхностно модифицированных силикагелях, для решения

каждой проблемы разделения требуется собственная система разделения, т. е. не подвижная плюс подвижная фаза. В ВЭЖХ используются почти без исключения смеси растворителей или градиенты для получения селективной системы разде ления.

Ниже будет дано описание характерных признаков механизмов разделения, которые приведены в табл. 4.4.

124 Глава 4. Примеры разделения из практики

Таблица 4.4. Механизмы разделения в ВЭЖХ, ГПХ и на Сефадексе LH-20

мл

Ê «À»:

В ВЭЖХ разделения начинаются после времени запаздывания t0, потому что это время, соответственно, объем элюирования, названный объемом задержки, необ ходимы подвижной фазе, чтобы пройти через всю заполненную подвижной фазой часть колонки, объем между гранулами и порами. Определение может осуществ ляться исключительно с помощью незамедляемого вещества, т. е. в это время или перед этим объемом элюирования разделение невозможно. Таким образом, разде

ления в ВЭЖХ на силикагеле (стандартная фаза) или поверхностно модифициро ванных силикагелях (RO , CN , NH2 и диол фазы) могут проводиться только тог да, когда вещества какой либо смеси по разному сильно запаздывают (обратимые взаимодействия).

Ê «Â»:

Молекулярно ситовая хроматография или эксклюзионная занимается только теми

разделениями, которые осуществляются внутри объема пор Vp по уменьшающему ся размеру молекул (молекулярный объем). В объеме между гранулами Vz разделе ние не может проходить, потому что все молекулы, которые больше, чем самые большие поры геля, элюируют неразделенными. Все другие, в молекулярном объе

ме меньшие, проходят возрастающие зоны молекулярного объема V0 с уменьшаю щимся размером и, соответственно, позднее элюируют. Позднее, с появлением са

мой маленькой молекулы в элюате, хроматографический процесс разделения в смыс ле обращенного эффекта сита закончен, т. е. согласно Vz + Vp. Для разделяемых ве

4.7. Сефадекс LH 20 в сравнении с ВЭЖХ и ГПХ 125

ществ доля подвижной фазы, находящаяся в пористом спектре, вместе с гелевой матрицей является собственной неподвижной фазой системы разделения. Переме щение молекул пробы внутри пор происходит исключительно через диффузию.

Ê «Ñ»:

Гидроксипропилированный декстрангель Сефадекс LH 20 упоминается в основ

ном, хотя и несправедливо, в связи с разделениями в смысле молекулярно ситовой хроматографии. Ссылки на то, что на этом геле да и на G типах возможны адсорб

ционно и распределительно хроматографические разделения, составляют, к со жалению, меньшинство. Именно разделения низкомолекулярных органических соединений (размер молекул < 1000), а таких очень много, делают этот декстран гель таким ценным, потому что, рассматривая с точки зрения механизма разделе ния, он является универсальной неподвижной фазой. Как уже наглядно показали

многочисленные примеры разделения, можно с полным основанием утверждать, что Сефадекс LH 20 c чистым растворителем в качестве подвижной фазы представ ляет собой комбинацию А + В. Это не так, чтобы только в зоне объема пор можно проводить разделение по уменьшающемуся размеру молекул. И в этом диапазоне могут проводиться адсорбционно хроматографические разделения через селектив ные взаимодействия с помощью гелевой матрицы. То, что вещества, которые элю

ируют в соответствии с Vz + Vp подвергаются адсорбционному эффекту, очевидно. Адсорбция низкомолекулярных соединений основывается главным образом на фор мировании различных по силе водородных связей и ван дер ваальсовых сил между растворенными компонентами пробы и набухшей гелевой матрицей.

ГЛАВА 5

ПРЕПАРАТИВНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ СЛОЖНЫХ СМЕСЕЙ ВЕЩЕСТВ

Часто бывает так, что разделяемая смесь веществ в чистых растворителях слабо растворима или не растворяется вообще. В таких случаях получается в большей

или меньшей степени «мутный» раствор. Причиной этого является то, что пробы состоят из соединений очень разной полярности. Тем не менее такие смеси мож но очень хорошо разделять посредством ступенчатого элюирования на не моди фицированном силикагеле. Для этого используют 2 3 разных по полярности ра

створителя в качестве элюента, которые применяют по возрастающей полярнос ти. С помощью этого метода можно количественно разделить многочисленные смеси веществ и без детектора. Конкретные примеры разделения можно взять из разделов 5.4 и 5.5 в этой главе. Там очень наглядно показано, какую большую пользу приносит на практике этот простой, но эффективный способ разделения. Такими сложными смесями веществ являются, например, прядильные препара ции различного состава, а также разнообразные реакционные продукты, являю щиеся смесями веществ натурального происхождения, как в различных формах экстрактов.

5.1. Прядильные препарации

Что значит прядильные препарации? Прядильные препарации – это неотъемле

мое вспомогательное средство в производстве синтетических волокон из полиэс теров, полиамидов, полиолефинов или других полимеров. Как правило, стандар тные прядильные препарации – это сложные органические смеси веществ. От

дельные компоненты выполняют разные задачи при переработке полимеров в во

локна [5.1 до 5.4].

5.2.Свойства современных прядильных препараций

Спомощью прядильных препараций к совершенно сухой нити подается вода и устраняется хрупкость благодаря умягчающим свойствам прядильной препара

ции. Затем в значительной степени снижается или даже устраняется способность

к трению с помощью «внешней» смазки и электростатический заряд путем добав ления антистатика. Прядильная препарация должна способствовать хорошей ком пактности у комплексной нити, быть хорошо смываемой, по возможности чис той водой и не иметь вредных для кожи свойств. Смесь веществ не должна вызы

вать коррозию металла или покрытия, быть легко эмульгируемой и иметь хоро шую устойчивость при хранении. В некоторых случаях содержать бактерицид.

Желательна также биологическая способность к расщеплению.

128 Глава 5. Препаративное разделение сложных смесей веществ

ными клеящими свойствами. Используются полиакрилаты, а также многочис ленные сополимеры с малеиновым ангидридом. Саркозиды кислот жирного ряда действуют так же, как средство для компактности нити, и одновременно имеют антистатическое действие.

5.3.5. Смачивающее средство (вспомогательный компонент)

Смачивающие средства добавляются в прядильную препарацию лишь в том слу

чае, когда смачивающего действия системы эмульгаторов недостаточно. Этокси

лированный полидиметилсилоксан применяется при случае в качестве смачива

ющего средства.

5.3.6. Бактерициды (вспомогательный компонент)

Прядильные препарации, как правило, наносятся в виде водной эмульсии или водного раствора. Используемая вода в большинстве случаев содержит бактерии. Во избежание бактериального разложения прядильной препарации, в основном эмульгаторов, в смесь веществ добавляют бактерициды. В качестве бактерицидов применяют следующие соединения: формальдегид, вещества, отщепляющие фор

мальдегид, хлорированные производные фенола, а также галогенированные ами ды кислот жирного ряда.

5.3.7. Средства защиты от коррозии (вспомогательный компонент)

Средства защиты от коррозии должны препятствовать действию ряда ПАВ, вызы вающих коррозию, и тем самым предупреждать опасность разъедания металличес ких деталей дорогостоящих текстильных станков. В качестве защитных средств от коррозии применяют среди прочего амины и их соли, а также четвертичные аммо

ниевые соединения. Глюконовая кислота действует как замедлитель коррозии, как и соли циклогексиламина. Как бактерициды, так и средства защиты от коррозии не имеют ничего общего с основными задачами прядильных препараций.

5.4. Колоночно жидкостный хроматографический анализ готовых препараций, компонентов и экстрактов волокон

Многочисленные изготовители готовых прядильных препараций предлагают так же и их отдельные компоненты, т. е. потребитель в состоянии сам выпускать свои собственные, оптимально подходящие для его технологии производства искусст венных волокон, смеси в качестве готовых прядильных препараций. Но всегда

можно определить, и это будет показано на конкретных продуктах, что данные

изготовителем количественные и/или качественные сведения по составу не соот

ветствуют фактически выявленным значениям. Информация о продукте не со

всем неверная, но просто недостаточно точная.

С помощью современных колоночно жидкостных хроматографических методов

можно разделить все готовые прядильные препарации и их компоненты как анали

5.4. Колоночно жидкостный хроматографический анализ готовых препараций... 129

тически [5.7 и 5.8], так и препаративно и тем самым подвергнуть точному качествен ному и количественному анализу. Этими возможностями инструментальной анали тики очень мало пользуются как изготовители, так и потребители этой продукции.

5.4.1. Препаративное предварительное разделение по возрастающей полярности

Препаративное предварительное разделение комплексных смесей веществ, таких как, например, прядильные препарации и экстракты волокон (остаточные прядиль ные препарации), осуществляется на не модифицированном силикагеле ступенча

то с помощью гексана, дихлорметана и метанола в качестве элюента и без индика ции. Это простой, но эффективный препаративный способ разделения, который можно применять и для других смесей веществ различной полярности и происхож дения. На рис. 5.1 наглядно показаны принцип и условия разделения. Этот метод

основывается на многолетнем опыте и применялся, как уже говорилось, очень ус пешно на многочисленных смесях веществ. Количественная оценка происходит с помощью взвешивания (гравиметрия!) после выпаривания элюента на ротационном испарителе. Тем самым он является очень точным методом определения. Количе ственная оценка неизвестных веществ возможна исключительно с помощью препа ративной колоночно жидкостной хроматографии при условии, что отделенные пики являются чистыми соединениями. При аналитических методах определения требу ются известные, т.е. идентифицированные, соединения, так называемые стандарты.

5.4.2. Гексан в качестве элюата

На силикагелевую колонку, предварительно кондиционированную (приведен ную в стандартное состояние при помощи гексана), самостоятельно заполнен ную (см. рис. 5.1 и 5.2), наносится проба (прядильная препарация, экстракт во локна или любая другая смесь веществ), растворенная или эмульгированная в гек сане, и затем элюируется с помощью углеводорода. Чем выше доля гидрофобных

и/или среднеполярных соединений в пробе, тем лучше растворимость в гексане. Если доля полярных соединений выше, то получают в большей или меньшей сте пени мутный раствор. С помощью 400 мл гексана (10 мл/мин) самые гидрофоб ные компоненты, такие как минеральные масла и парафины, количественно от деляются от других веществ смеси.

5.4.2.1. Идентификация

Уже из консистенции, жидкая или парафинистая, можно определить, имеется минеральное масло или парафин. Для идентификации этих компонентов требу ются минимальные затраты. Если необходимо, то определяются самые характер ные свойства, такие как область кипения и вязкость или точка размягчения.

5.4.3.Дихлорметан в качестве элюата

Водном и том же направлении после гексана прокачиваются 6 × 200 мл дихлор метана. В шести фракциях, которые улавливаются с помощью сборника фракций,