Файловый архив студентов. Файловый архив студентов.
1261 вуз, 4603 предмет.
/ Регистрация
FAQ Обратная связь Вопросы и предложения
Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова
Предмет:
Промышленная биотехнология
Файл:

Хенке_Жидкостная хроматография [2009]

.pdf
Скачиваний:
212
Добавлен:
29.06.2020
Размер:
35.96 Mб
Скачать
☆

 

 

 

Приложение

231

 

 

 

 

 

Растворимые

Pro C18

Хорошие пики для оснований

 

в жирах

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ODS A

Классическая фаза С18

 

 

 

 

 

 

ODS AM

Фаза С18 с исключительной

 

 

 

воспроизводимостью от лота к лоту

 

 

 

 

 

Нормальная фаза

Растворимые

Poliamin II

Амино-колонка с улучшенным

 

 

â âîäå

 

ресурсом срока службы

 

 

 

 

 

 

 

Amino

Амино-колонка, использующая

 

 

 

полярность амино-групп

 

 

 

 

 

Растворимые

Silica

Непривитый силикагель

 

в жирах

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Poliamin II

Амино-колонка с улучшенным

 

 

 

 

ресурсом срока службы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Сахара

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обращенная фаза

Олигосахариды

Hydrosphere C18

Может использоваться со 100%

 

 

 

водным элюентом

 

 

 

 

 

 

ODS AQ

Более сильное удерживание

 

 

 

гидрофильных соединений,

 

 

 

чем на стандартной ODS

 

 

 

 

Нормальная фаза

Ìîíî,

Poliamin II

Улучшенная гидролитическая

 

Олигосахариды

 

стабильность и альтернативная

 

 

 

селективность по сравнению

 

 

 

с обычными амино-фазами

 

 

 

 

 

 

 

Amino

Амино-колонка, использующая

 

 

 

полярность амино-групп

 

 

 

 

 

 

 

Poliamin

Колонка с химически-привитой

 

 

 

 

полиаминной фазой

 

 

 

 

 

Гельфильтрация

 

Diol

Для разделения сахаров

 

 

 

по молекулярным весам

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Органические кислоты. Жирные кислоты

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обращенная фаза

Органические

Hydrosphere C18

Может использоваться со 100%

 

кислоты

 

водным элюентом

 

 

 

 

 

 

ODS AQ

Более сильное удерживание

 

 

 

гидрофильных соединений,

 

 

 

чем на стандартной ODS

 

 

 

 

Нормальная фаза

 

Silica

Непривитый силикагель

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Аминокислоты

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обращенная фаза

Свободные

Hydrosphere C18

Может использоваться со 100%

 

аминокислоты

 

водным элюентом

 

 

 

 

 

Меченые

ODS AM

Фаза С18 с исключительной

 

аминокислоты

 

воспроизводимостью от лота к лоту

 

 

 

 

 

 

Pro C18

Хорошие пики благодаря новейшей

 

 

 

технологии эндкепирования

 

 

 

 

 

 

Hydrosphere C18

Может использоваться со 100%

 

 

 

водным элюентом

 

 

 

 

 

recl priloj_new.p65

231

26.11.2008, 12:32

232 Приложение

Белки, пептиды

Обращенная фаза

M.W. <10,000

 

Pro C18

Хорошие пики благодаря новейшей

 

 

 

 

технологии эндкепирования

 

 

 

 

 

 

 

 

ODS серия

ODS-колонки серийного производ-

 

 

 

 

ñòâà

 

 

 

 

 

 

 

 

Protein RP

Специально для разделений

 

 

 

 

белков и пептидов с уникальной

 

 

 

 

устойчивостью к кислотам

 

 

 

 

 

 

 

 

YMCbasic

С8 фаза. Подходит для разделений

 

 

 

 

пептидов, благодаря минимизации

 

 

 

 

вторичных взаимодействий

 

 

 

 

 

 

M.W. >10,000

 

Protein RP

Колонки с широкими порами подходят

 

 

 

 

для разделений макромолекул

 

 

 

 

Специально для разделений

 

 

 

 

белков и пептидов с уникальной

 

 

 

 

устойчивостью к кислотам

Гельфильтрация

 

 

Diol

Подходит для анализа белков

 

 

 

 

и пептидов

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Нуклеиновые кислоты

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обращенная фаза

Основания

 

Hydrosphere C18

Может использоваться со 100%

 

нуклеиновых

 

 

водным элюентом

 

кислот,

 

 

 

 

нуклеозиды,

 

 

 

 

нуклеотиды

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ODS AQ

Более сильное удерживание

 

 

 

 

гидрофильных соединений,

 

 

 

 

чем на стандартной ODS

 

 

 

 

 

 

Олигосахариды

 

Hydrosphere C18

Может использоваться со 100%

 

 

 

 

водным элюентом

 

 

 

ODS AQ

Более сильное удерживание

 

 

 

 

гидрофильных соединений,

 

 

 

 

чем на стандартной ODS

 

 

 

ODS A

Фаза С18 с широкими порами

 

 

 

 

Подходят для разделений

 

 

 

 

макромолекул

Гельфильтрация

 

 

Diol

Подходит для разделения

 

 

 

 

олигонуклеотидов и нуклеиновых

 

 

 

 

кислот

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Структурные изомеры

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Хиральные

 

 

CHIRAL CD-BR

Циклодекстриновая фаза для

разделения

 

 

 

разделения оптических изомероверов

 

 

 

 

 

 

 

 

CHIRAL NEA

Колонка макромолекулярного типа

 

 

 

 

для НФ и ОФ разделения оптических

 

 

 

 

èçîì

 

 

 

 

 

recl priloj_new.p65

232

26.11.2008, 12:32

Приложение 233

Семейство стационарных фаз ProFamily для обращенно!фазной хроматографии

Новейшая разработка YMC для обращенно фазной хроматографии включает: гидро фобная фаза Pro C18 Rs с высоким (~ 22 %) содержанием углерода и расширенным интервалом pH; стабильная при использовании 100% водных элюентов гидрофильная Hydrosphere C18; стационарные фазы Pro C18, Pro C8, Pro C4.

 

 

Pro C18

 

Pro C8

 

Pro C4

C18 RS

 

Hydrosphere Ñ18

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Размер частиц, µm

3; 5

 

3; 5

 

3; 5

3; 5

 

3; 5

Размер пор, nm

12

 

12

 

12

12

 

12

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Площадь поверхности, m2g–1

340

 

340

 

340

340

 

340

Содержание углерода

 

17

 

11

 

8

22

 

12

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Интервал pH

2–8

 

2–8

 

2–8

 

1–10

 

 

2–8

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание металлов (случайная выборка)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Al, ppm (< 10 ppm)

 

0,3

0,2

 

0,6

 

0,3

 

0,7

Fe, ppm (< 10 ppm)

 

2,8

2,5

 

2,9

 

0,1

 

1,2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Na, ppm (< 10 ppm)

 

0,3

1,4

 

1,0

 

1,3

 

0,7

Ti, ppm (< 10 ppm)

 

0,1

0,1

 

0,1

 

0,1

 

0,1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

HPLC Test A

1. Uracil

Колонка: 150 x 4.6 mm i.d.

2. 4-n-Butoxybenzoic

Элюент: 20mM KH2PO4-

acid

H3PO4 (pH 3,5) /

 

ацетонитрил (40/60)

3. Ethyl benzene

Скорость потока: 1.0 ml/min

4. n-Propyl benzene

Температура: 37° C

 

Детектор: UV at 254 nm

 

 

 

HPLC-Test A

 

Спецификация

 

 

 

k′(Ethyl benzene)/

 

 

k′(n-Propyl benzene)

 

0.629–0.653

k′(4-n-Butoxybenzoic adic)/

 

k′(n-Propyl benzene)

 

0.238–0.263

Тест на инертность

1.

Pyridine (0,035 ìl/ml)

Элюент: Метанол / Вода

Температура: 37° C

2.

Phenol (0,4 mg/ml)

Скорость потока: 1.0 ml/min

Детектор: UV at 254 nm AUFS

recl priloj_new.p65

233

26.11.2008, 12:32

234 Приложение

Колонки YMC для гидрофильной (HILIC) хроматографии

•Фазы YMC HILIC идеальны для анализа крайне поляр ных соединений

•YMC предлагает HILIC колонки для анализа соедине ний в широком диапазоне полярности

•Совместимы с LC MC системами

YMC HILIC

 

Silica

PVA-Sil

Amino

Polyamine II

Cyano

Diol

Размер частиц, µm

3; 5; 10;

5

3; 5; 10

5

3; 5; 10; 15

5; 10; 15

 

15; 20; 50

 

 

 

 

 

Размер пор, nm

6; 12; 20; 30

12

12

12

12; 30

6; 12; 20; 30

 

 

 

 

 

 

 

Содержание углерода, %

n/a

4; 3

3

n/a

7; 2.5

n/a

Интервал pH

2,0–7,5

2,0–9,5

2,0–7,0

2,0–9,0

2,0–7,5

2,0–7,5

 

 

 

 

 

 

 

Пептиды на YMC-Pack Diol

1. TRP-GLY

2. GLY-GLY-PHE

3. Angiotensin I

4. Substance P

5. Insulin

Колонка:

YMC-Pack Diol 50 x 4.6 mm i.d.

Элюент:

A) Ацетонитрил/TFA/TEA (100 /0,1 /0,1)

 

B) Âîäà/TFA/TEA (100 /0,1 /0,1)

 

0–50% B (0-4 min) 50% B (4–5 min)

Скорость потока:

3.0 ml/min

Температура:

комнатная

Детектор:

UV at 220 nm

recl priloj_new.p65

234

26.11.2008, 12:32

Приложение 235

Салициловая кислота YMC-Pack PVA-Sil

Колонка:

100 x 3.0 mm i.d. (5 µm, 12 nm)

Элюент:

Ацетонитрил / CH3COONH4; 200 mM, pH 5,5(95/5)

Скорость потока:

0.9 ml/min

Детектор:

UV at 275 nm

Колонки YMC для Биохроматографии

•C18 с широкими порами для разделения пептидов и протеинов

•Гидрофильная фаза C18

•C8 с широкими порами для разделения сравнительно сильно гидрофобных соединений

•C4 с широкими порами, для селективности отличной от C18

 

ODS-A

ODS-AQ

C8

C4

Protein RP

Diol

Poliamin II

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Размер частиц, µm

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Аналитический

3, 5

 

3, 5

3, 5

5

5

5

5

 

 

 

 

 

 

 

 

Препаративный

10; 15; 20; 50

10, 15, 20, 50

10, 15, 50

10, 15, 20

–

15, 50

–

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Размер пор, nm

12 20

30

12 20

12 20 30

12 20 30

патент

6 12 20 30

12

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Площадь

 

 

 

 

 

 

 

 

поверхности, m2g–1

330 175

100

330 175

330 175 100

330 175 100

–

650 330 175 100

–

Содержание

 

 

 

 

 

 

 

 

углерода %

17 12

7

14 10

10 7 4

7 5 3

4

–

–

 

 

 

 

 

 

 

 

Интервал pH

2,0–7,5

2,0–7,5

2,0–7,5

2,0–7,5

1,5–7,5

2,0–7,5

2,0–9,0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

recl priloj_new.p65

235

26.11.2008, 12:32
Влияние размера пор на разделение пептидов и протеинов

236 Приложение

Применение ВЭЖХ для биологических разделений – перспективная и бурно развивающаяся область. За последние 10–15 лет, в связи с появлением сверхчисто

го силикагеля и технологий устранения активных силанольных групп, появилась возможность использовать обращенно фазную ВЭЖХ для аналитического и пре паративного разделения белков, нуклеиновых кислот и подобных соединений. Ра

нее денатурация биомолекул и/или низкий выход тормозили работу в этой облас

ти. Колонки для биохроматографии отличаются от обычных ВЭЖХ колонок или увеличенным размером пор для больших молекул, или химическим составом, по зволяющим использовать элюенты для биомолекулярной химии, типа ТФУ.

При исследовании зависимости времени удержания аналита от содержания (%) в элюенте органического растворителя обнаружено интересное различие поведе ния небольших органических молекул от поведения протеинов.

Небольшие органические молекулы элюируются в соответствии с распреде

лительным механизмом разделения, на что указывает линейная зависимость вре мени удержания от содержания растворителя. Наоборот, для пептидов и проте инов эта зависимость существенно нелинейная и может быть объяснена адсор бционным механизмом. Поэтому в этом случае важно тщательно изучить влия ние размера пор,

который будет иметь ключевое значение для разрешения и выхода при разделе нии пептидов и про теинов.

Результаты ис следований влияния размера пор на раз

деление пептидов и протеинов приведены в таблице слева. Как показано в табли це слева, колонка C18 с порами размером 12 nm подходит для маленьких пепти дов весом до 5000 Дальтон. Для разделения больших пептидов и маленьких проте инов наиболее эффективна

фаза C8 с порами размером 20 nm. Большинство протеи нов эффективно элюируется

на колонке C4 с порами раз

мером 30 nm.

Однако, на разделение может влиять также гидро фобность пептидов / проте

инов и природа привитой фазы. Поэтому приведенную

информацию следует рас сматривать как начальный шаг оптимизации.

recl priloj_new.p65

236

26.11.2008, 12:32

Приложение 237

1.Cytochrome c (MW: 12,400)

2.Insulin (MW: 5,700)

3.Amyloid β-protein (MW: 4,300)

4.Lysozyme (MW: 14,400)

5.a-Lactalbumin (MW: 14,200)

6.Myoglobin (MW: 17,000)

Колонка:

150 x 4.6 mm i.d. 5 µm

Элюент:

A)Âîäà/TFA (100/0,1)

 

B)ACN/TFA (100/0,1)

Скорость потока:

1.0 ml/min

Температура:

37° C

Детектор:

UV at 220 nm

Применение

Колонки YMC для биохроматографии это обращенно фазные колонки с разме ром пор 20 или 30 nm, с функциональной группой C18, C8, C4 что позволяет по

добрать оптимальный размер пор и стационарную фазу.

Интересную альтернативу представляют колонки YMC Pack Protein RP с дру гой селективностью и стабильностью к TFA.

Для анализа полисахаридов, гликопротеинов, нуклеиновых кислот и сходных соединений альтернативой стандартным амино колонкам является YMC Pack Polyamine II – амино фаза на полимерной основе.

recl priloj_new.p65

237

26.11.2008, 12:32

238 Приложение

Олигонуклеотиды

 

1.

c-Ha-ras/12 (20 mer)

 

 

 

 

 

GTGGGCGCC-AGC-GGTGTGGG

 

 

 

Ser

 

 

 

 

 

2.

c-Ha-ras/12 (20 mer)

 

 

 

 

 

GTGGGCGCC-GCC-GGTGTGGG

 

 

 

Ala

 

 

 

 

 

3.

c-Ha-ras/12 (20 mer)

 

 

 

 

 

GTGGGCGCC-GAC-GGTGTGGG

 

 

 

Asp

 

 

 

 

 

4.

c-Ha-ras/12 (20 mer)

 

 

 

 

 

GTGGGCGCC-GTC-GGTGTGGG

 

 

 

Val

 

 

 

 

 

5.

c-Ha-ras/12 (20 mer)

 

 

 

 

 

GTGGGCGCC-CGC-GGTGTGGG

 

 

 

Arg

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Колонка:

 

 

 

YMC-Pack C4 5 µm, 30 nm, 150 x 4.6 mm i.d.

Элюент:

 

 

A) 100 mM Triethylamine-acetic acid (pH 6.5) / acetonitrile (94/6)

 

 

 

 

B) 100 mM Triethylamine-acetic acid (pH 6.5) / acetonitrile (85/15)

 

 

 

 

0%-100% B (0-25 min., linear)

Скорость потока:

1.0 ml/min

 

 

 

Температура:

 

 

30° C

 

 

 

Детектор:

 

 

 

UV at 260 nm

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Протеины

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Ribonuclease A

 

 

 

 

 

 

2. Cytochrome c

 

 

 

 

 

 

3. Lysozyme

 

 

 

 

 

 

4. Myoglobin

 

 

 

 

 

 

Колонка:

 

 

YMC-Pack C4 5 µm, 30 nm, 150 x 4.6 mm i.d.

 

Элюент:

 

A) acetonitrile / water / TFA (5/95/0.1)

 

 

 

 

 

B) acetonitrile / water / TFA (60/40/0.1)

 

 

 

 

 

30%-90% B (0-20 min., linear),

 

 

 

 

 

90% B (20-50 min)

 

Скорость потока:

1.0 ml/min

Температура:

37° C

Детектор:

 

UV at 220 nm

 

 

 

 

 

 

 

 

recl priloj_new.p65

238

26.11.2008, 12:32

Приложение 239

Анализ соединений с большой гидрофобностью

Колонки YMC с широкими порами также подходят для анализа соединений с боль шой гидрофобностью. На хроматограммах ниже сравнивается удержание алкил бензолов на сорбенте YMCPack ODS A с разным размером пор. Соединения с большей гидрофобностью элюируются быстрее на YMC Pack ODS A 30 nm чем

на ODS A 12 nm.

Для соединений с высокой гидрофобностью

Колонка: YMC-Pack ODS-A

5µm, 12 nm, YMC-Pack ODS-A

5µm, 30 nm

150 x 4.6 mm i.d.

Элюент:

acetonitrile / water /

 

TFA (5/95/0.1)

Скорость

 

потока:

1.0 ml/min

Температура:

30° C

Детектор:

UV at 254 nm

Колонки для разделения пептидов и протеинов

YMC Pack Protein RP – Бутиловая (C4) стационарная фаза для обращенно фаз ной хроматографии с широкими порами и большим временем жизни при работе с кислотными элюентами. Специально разработана для разделения высокомо лекулярных пептидов и протеинов. Соответствует стандарту фармакопеи США USP L26.

•Широкие поры, короткие алкильные цепочки для об ращенно фазного разделения пептидов и протеинов.

•Ультрачистая силикагелевая основа

•Высокая стабильность при использовании кис лотного буфера

•Прекрасная селективность и выход для пепти дов и протеинов.

•Спецификация:

Размер частиц: 5µm

Рекомендуемый интервал pH: 1.5–7.5.

recl priloj_new.p65

239

26.11.2008, 12:32

240 Приложение

Высокая химическая стабильность

Вколонках YMC Pack Protein RP устранено главное ограничение по использова нию RP фаз с короткими алкильными цепочками в биомолекулярном анализе.

Втаких колонках водно кислотный элюент, типа 0,1% ТФУ, часто приводит к уменьшению удержания и разрешения. Protein RP использует патентованную ме

тодику прививки и блокирования концевых групп (endcapping) для получения ста ционарной фазы, устойчивой к используемым при анализах протеинов и пепти

дов элюентам.

Приведенные ниже графики иллюстрирует превосходную стабильность удержа ния, показанную Protein RP. Практически удержание не менялось в течение 16 дней

непрерывной прокачки 0,1% ТФУ. На обычных колонках C4 удержание дифени

ла падает со временем. Это вызвано отрывом бутильных групп силикагелевой ос новы из за кислотного гидролиза.

Протеины

Колонка:

YMC-Pack Protein-RP,

 

250 x 4.6 mm i.d.

Элюент:

A) Ацетонитрил /

 

Âîäà(40 / 60)

Скорость

 

потока:

1.0 ml/min

Температура:

30° C

Детектор:

UV at 254 nm

 

0.32 AUFS

Условия прокачки

 

Элюент:

Âîäà / TFA (100/0,1)

Скорость потока:

1.0 ml/min

Температура:

Комнатная

recl priloj_new.p65

240

26.11.2008, 12:32
Соседние файлы в предмете Промышленная биотехнология
Помощь Обратная связь Вопросы и предложения Пользовательское соглашение Политика конфиденциальности