2.3 Определение валидационных характеристик и критериев приемлемости

Валидация МИ включает 3 основных этапа:

1. Получение валидационных характеристик;

2. Сравнение полученных величин с критическими значениями (критерии приемлемости);

3. Выводы о корректности методики.

Таким образом, валидация методики обязательно предполагает формулировку и обоснование критериев приемлемости, без которых валидация в принципе невозможна.

Критерии приемлемости (ассерtance criteria) – количественные предельные значения, интервалы или другие подходящие критерии соответствия результатов испытаний установленным требованиям.

Необходимые критерии приемлемости и процедура проведения валидации должны разрабатываться для конкретных методик с учетом их специфики.

Для МИ количественного анализа при выборе критериев валидации основываются на применении принципа незначимости [17].

Доверительный интервал ∆₂ является значимым на уровне Р, % (незначимым на уровне 100-Р%) по сравнению с доверительным интервалом ∆₁, если объединенный доверительный интервал ∆p превышает ∆₁ не более, чем на Р%, т.е.:

. (2.1)

Можно задаться любым уровнем значимости Р. В аналитической практике обычно принят уровень значимости Р=5%. В этом случае решением этого соотношения будет неравенство:

. (2.2)

Это неравенство является основным выражением принципа незначимости при выработке валидационных критериев приемлемости. Доверительный интервал ∆₂ является незначимым по отношению к доверительному интервалу ∆₁, если выполняется условие 1.

Так как при контроле лекарственных средств (ЛС) неопределенность измерений (или ее составляющая) не должна значимо влиять на принятие решений о качестве лекарственного средства, то используя принцип незначимости можно определить предельно допускаемую неопределенность измерений, которая будет различаться для субстанций и готовых ЛС.

В случае субстанций содержание основного вещества известно до проведения количественного определения. Оно равно 100% минус содержание примесей (примеси определяются в других тестах). Для фармацевтических субстанций содержание примесей (кроме воды) обычно очень незначительно и незначимо по сравнению с допусками содержания субстанции по спецификации (± В%). Таким образом, при количественном определении субстанций лишь подтверждается, что найденное содержание основного вещества статистически значимо не отличается от 100%. Поэтому допуски содержания для субстанций определяются только предельно допустимой неопределенностью самого количественного определения ( %), т.е. для субстанции:

. (2.3)

При количественном определении готовых ЛС важна фактическая концентрация анализируемого вещества (которая может колебаться в очень широких пределах за счет технологических факторов). Необходимо доказать, что найденная концентрация находится в пределах допусков содержания (± В%).

В соответствии с принципом незначимости, предельная неопределенность методики количественного определения готового лекарственного средства (ЛС) ( %) должна быть незначима по сравнению с допусками содержания (±В%). В этом случае она значимо не влияет на принятие решений о качестве, т.е. для ЛС:

. (2.4)

В фармакопейном анализе (хроматографии, спектрофотометрии) удобно использовать нормализованные координаты. При проведении валидационных исследований независимой переменной (абсциссой Х) выступает концентрация, а зависимой (ординатой Y) – аналитический сигнал (высота или площадь пика, оптическая плотность и т.д.). Концентрации и аналитические сигналы различных веществ могут находиться в самых разных цифровых диапазонах, что требует расчета критериев для каждого конкретного случая. Нормализованные координаты представляют собой не реальные величины (концентрации и аналитические сигналы), а проценты к номинальному (нормируемому) значению.

Использование нормализованных координат позволяет сформулировать единые критерии, связанные только с допусками содержания, но не зависящие от специфики конкретных веществ.

Пусть C_i – концентрация анализируемого вещества в i-ом анализируемом растворе (или образце), C_st – концентрация этого же вещества в растворе (или образце) сравнения (которая очень близка к номинальной концентрации). Аналогично: A_i – аналитический сигнал анализируемого вещества для i-ого анализируемого раствора, A_sti – аналитический сигнал этого же вещества для раствора сравнения. Нормализованные координаты X_i, Y_i и Z_i определяются следующим образом:

, (2.5)

, (2.6)

, (2.7)

Преимущества нормализованных координат по сравнению с исходными величинами C_i , C_sti, A_i, A_sti:

1. Величины X_i и Y_i , независимо от специфики анализируемого вещества, всегда находятся в пределах одного диапазона применения методики анализа − вблизи 100%. Величина Z_i представляет собой коэффициент извлечения («найдено» в % к «введено»).

2. График линейной зависимости Y_i от X_i ( ), независимо от специфики анализируемого вещества, всегда лежит в одном и том же диапазоне (см. п. 1). Угол наклона прямой (b) всегда близок к 1. Свободный член прямой (a) незначимо (статистически или практически) отличается от нуля. Это стандартизует представление графика линейной зависимости и делает его наглядным.

3. Разброс точек Y(X) в координатах Y – X можно охарактеризовать стандартными отклонениями SD_Y или SD_X. Так как средние значения величин X_i и Y_i близки к 100%, то величины SD_Y и SD_X являются относительными (по отношению к номинальным или нормируемым значениям) стандартными отклонениями и, учитывая п. 2, близкими друг к другу:

. (2.8)

4. Величины Z_i соотношения (2.7) для точек регрессионной прямой характеризуются средним значением и стандартным отклонением SD_Z, которое, учитывая близость величины к 100 %, фактически, является относительным стандартным отклонением. Поэтому неопределенность методики анализа во всем диапазоне концентраций характеризуется доверительным интервалом, равным доверительному интервалу единичного значения Z:

, (2.9)

где – максимально допустимое значение неопределенности измерений; – коэффициент Стьюдента для одностороннего распределения, доверительной вероятности 0,95 и числа степеней свободы .

Специфичность (избирательность). Испытания по оценке специфичности должно проводиться при валидации всех типов МИ (испытаний на подлинность, контроль примесей и количественное определение).

Способ подтверждения специфичности зависит от задач, для решения которых предназначена данная МИ.

Испытания на подлинность. Испытания на подлинность должны обеспечивать возможность различать соединения, имеющие сходную структуру. Специфичность МИ подтверждается путем сравнения результатов испытаний образцов, содержащих известный определяемый компонент (например, приготовленных с использованием стандартных образцов (СО)), и образцов, не содержащих данный компонент. Возможно, проведение дополнительных испытаний на подлинность для структурно сходных или химически родственных веществ определяемому компоненту. Выбор таких веществ, способных повлиять на результаты, должен иметь правильное научное обоснование с рассмотрением возможных последствий.

Количественное определение и испытания на примеси. Для различных методов разделения должен быть аналогичный подход при подтверждении специфичности.

Специфичность МИ считается доказанной, если ни используемый растворитель, ни реактивы, ни компоненты плацебо (смесь всех ингредиентов лекарственного препарата без определяемого вещества) не искажают результат в пределах требуемой точности.

Например, специфичность может быть определена путем сравнения результатов испытания определяемого компонента в образце с добавлением и без добавления определяемого вещества или потенциально мешающих веществ. Специфичность может быть также подтверждена анализом образцов (проб), подвергнутых и не подвергнутых стрессовым испытаниям (т.е. из испытаний по оценке стабильности определяемого вещества в стрессовых условиях).

При использовании неспецифического метода количественного определения следует применять дополнительные аналитические методики и подтверждать специфичность всего комплекса методик.

Например, при подтверждении специфичности для МИ с использованием метода хроматографического разделения получают хроматограммы определяемого вещества, подвижной фазы, растворителя, плацебо а также примесей. При отсутствии примесей могут использоваться хроматограммы из стрессовых экспериментов.

При наличии образцов примесей определение специфичности МИ состоит в следующем:

− для МИ количественного определения необходимо подтверждение специфичности в присутствии примесей; практически это осуществимо добавлением в чистые вещества (фармацевтическую субстанцию или лекарственное средство) примесей в определенной концентрации и последующим доказательством того, что присутствие данных веществ не влияет на результат количественного определения;

− при испытаниях на чистоту специфичность может быть подтверждена посредством добавления в фармацевтическую субстанцию или лекарственное средство примесей в определенных концентрациях и доказательства разделения этих примесей друг от друга и других компонентов образца.

При отсутствии образцов примесей определение специфичности определяемых компонентов состоит в следующем:

− специфичность МИ для количественного анализа примесей подтверждается сравнением результатов испытания образцов (проб), содержащих примеси или продукты разложения, предлагаемой и арбитражной методики, например фармакопейного метода или арбитражной валидированной МИ. В данное исследование целесообразно включать образцы (пробы), хранившиеся в соответствующих стрессовых условиях (воздействие света, тепла, влажности, кислотно-основной гидролиз и окисление);

− специфичность МИ для количественного анализа (содержание/активность) подтверждается сравнением результатов испытания образцов (проб), полученных с использованием валидируемой и арбитражной методики;

− специфичность МИ при испытании на примеси (предельное значение) подтверждается сравнением профилей примесей, полученными с использованием валидируемой и арбитражной методики.

Для доказательства соответствия пика определяемого компонента только одному компоненту могут быть проведены исследования на чистоту пиков (например, использование диодно-матричного детектирования, масс-спектрометрии).

Ориентировочный перечень вопросов, на которые должны быть даны исчерпывающие ответы при определении специфичности:

− позволяет ли данный метод испытаний идентифицировать и количественно определить содержание определяемого компонента в каждой анализируемой пробе;

− наблюдается ли негативное влияние других соединений с аналогичной структурой;

− наблюдается ли негативное влияние любых других соединений;

− можно ли идентифицировать все пики на хроматограмме или же дифференцировать их как не относящиеся к определяемому компоненту;

− были ли проанализированы образцы, подвергнутые стрессовым испытаниям? Наблюдалось ли негативное влияние продуктов разложения.

Линейность. Исследования линейности целесообразно совместить с исследованиями прецизионности и правильности, что позволяет существенно сократить объем эксперимента.

Линейная зависимость должна быть определена в пределах диапазона применения МИ. Линейность МИ доказана, если в выбранном диапазоне применения может быть доказана линейное соотношение между концентрацией исследуемого вещества и фактором отклика.

Линейная зависимость предлагаемой МИ может быть подтверждена непосредственно при испытании серии образцов, полученных путем разбавления исходного раствора или с использованием растворов, приготовленных путем точного взвешивания компонентов лекарственного средства. Концентрации (количества) определяемого компонента в образцах должны перекрывать требуемый диапазон применения МИ.

Линейность оценивается визуально по графику зависимости сигнала как функции концентрации или количества определяемого компонента. Полученные результаты должны быть обработаны подходящими статистическими методами, например, путем вычисления регрессионной линии методом наименьших квадратов. При отсутствии линейности данные испытаний следует подвергнуть математическому преобразованию до проведения регрессионного анализа. В некоторых случаях ни при каких математических преобразованиях линейность не наблюдается. В таких случаях аналитический сигнал должен быть описан соответствующей функцией концентрации (количества) определяемого компонента в образце (пробе).

Для подтверждения линейности должны быть определены и представлены: коэффициент корреляции, точка пересечения с осью Y, тангенс угла наклона линии регрессии и остаточная сумма квадратов отклонений. Должен быть приложен график со всеми данными.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят для МИ, в которых предусмотрено установление градуировочной зависимости. Контроль стабильности градуировочной характеристики заключается в проверке параметров градуировочной зависимости при каждой серии измерений, сопоставлении их с первоначальными параметрами и установлении на этой основе возможности продолжения текущих измерений или необходимости коррекции градуировочной характеристики. Число точек контроля не менее трех.

Ориентировочный перечень вопросов, на которые должны быть даны исчерпывающие ответы при определении линейности:

− приводят ли результаты испытаний серии растворов, приготовленных из СО, к линейной зависимости? Какой коэффициент корреляции;

− является ли наклон прямой, построенный по результатам испытаний растворов, приготовленных разбавлением исходного образца таким же, как и наклон прямой, построенный по результатам испытаний растворов, приготовленных путем растворения точно взвешенных навесок СО;

− носит ли график зависимости фактора отклика от концентрации определяемого компонента линейный характер;

− какое математическое преобразование применялось при отсутствии линейной зависимости, какой зависимостью выражается аналитический сигнал как функция содержания определяемого компонента.

Критерии приемлемости. Для валидации линейности измеряется и анализируется как минимум 5 концентраций, причем значения для каждого анализа получается путем расчета среднего значения из нескольких измерений.

При использовании нормализованных координат, параллельно проводится измерение и для раствора сравнения с концентрацией, близкой к номинальной.

Для модельных растворов методом наименьших квадратов рассчитывают линейную зависимость:

. (2.10)

В нормализованных координатах:

, (2.11)

где а – свободный член для рассчитанной регрессионной прямой (отрезок, отсекаемый на оси ординат); b – угол наклона для рассчитанной регрессионной прямой. Коэффициенты регрессии а и b рассчитываются в соответствии с выражением 2.12 и 2.13.

, (2.12)

, (2.13)

где n – число измерений (если точек 5 в трех повторах, то n =15); Х_i –концентрация в i-той точке графика; Y_i – отклик i-той точке графика.

_{Выражение для свободного члена а может быть записано через b в форме:}

. (2.14)

Для проведения расчетов по методу наименьших квадратов можно использовать программу Microsoft Excel (входит в программный пакет Microsoft Office). Можно использовать следующие встроенные функции Microsoft Excel: «ОТРЕЗОК» (диапазон Y; диапазон X); «НАКЛОН» (диапазон Y; диапазон X); «КОРРЕЛ» (диапазон Y; диапазон X). Первая функция вычисляет свободный член уравнения регрессии а, вторая – наклон прямой b. Третья функция позволяет вычислить коэффициент корреляции r.

Требования к остаточному стандартному отклонению (S₀) [17]. Доверительный интервал разброса точек вокруг прямой равняется произведению коэффициента Стьюдента на остаточное стандартное отклонение S₀.

Остаточное стандартное отклонение S₀, характеризующее рассеяние результатов экспериментальных данных относительно построенной прямой, рассчитывается по следующей формуле:

(2.15)

где Y_i – измеренное значение для i-той точки графика; Y_ip – расчетное (по уравнению ) значение для i-той точки графика; n – число измерений.

Если не использовались нормализованные координаты и Y_i – отклик в абсолютных единицах, то относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации) равен:

(2.16)

Односторонний доверительный интервал не должен превышать предельно допустимую неопределенность методики анализа max :

(2.17)

где b – угол наклона для рассчитанной регрессионной прямой; – коэффициент Стьюдента для одностороннего распределения, доверительной вероятности 0,95 и число степеней свободы .

Подставляя в формулу значения предельно допустимой неопределенности для субстанций (формула 2.3) и ЛС (формула 2.4) получим следующую выражение для остаточного стандартного отклонения при известном допуске содержания (±В %)

для субстанции:

, (2.18)

для лекарственных средств:

_. (2.19)

В нормализованных координатах b приближается к 1 и формулы 2.18 и 2.19 имеют вид

для субстанции:

, (2.20)

для лекарственных средств:

_. (2.21)

Используя уравнения (2.18−2.19), предельные величины RSD₀ можно табулировать для различных допусков содержания. Для тестов «Растворение» и «Однородность содержания» предельные значения RSD₀ рассчитывают исходя из того, что Δ_As=3,0% (табл. 2.1).

Требования к свободному члену (а). Требования к свободному члену а могут быть двух типов:

Критерий статистической незначимости. Свободный член а статистически незначимо отличается от нуля, если он не превышает свой доверительный интервал (Δ_A):

, (2.22)

_где, RSD_а – стандартное отклонение для отрезка, который отсекается на оси ординат (для рассчитанной регрессионной прямой); – коэффициент Стьюдента для одностороннего распределения, доверительной вероятности 95% и числа степеней свободы _.

Стандартное отклонение RSD_а рассчитывается по формуле:

. (2.23)

Критерий практической незначимости. Если первый критерий не выполняется, используют критерий практической незначимости для свободного члена а. Вклад свободного члена в неопределенность результата анализа должен быть незначим в сравнении с максимально допустимой неопределенностью результата анализа. Поскольку максимальная погрешность вносится на границе диапазона, в котором методика должна давать корректные результаты, к свободному члену предъявляют следующие требования:

, (2.24)

где Х_min – минимальная граница диапазона применения методики (может быть 80, 70 или 55%), а величина maxΔ_As должна удовлетворять соотношениям (2.3−2.4).

Требования к коэффициенту корреляции r.

Общий индекс корреляции R_c, частным случаем которого является коэффициент линейной корреляции r, определяется по формуле:

, (2.25)

где RSD_y – коэффициент вариации отклонений величин Y_i относительно среднего значения , определяемый по формуле:

. (2.26)

Подставляя в уравнение (2.25) величины RSD_y (формула 2.26) и предельные значения RSD₀ (формула 2.18−2.19), получим критические (минимальные) значения коэффициента корреляции r для различных испытаний:

, (2.27)

где – максимальная неопределенность измерений (формула 2.3−2.4).

В нормализованных координатах формула 2.27 примет вид:

. (2.28)

Иногда удобно проводить валидацию методики, которая была бы пригодна одновременно для проведения тестов «Количественное определение» (КО), «Однородности содержания» (ОС) и «Растворение» (Р). В этом случае в качестве допусков содержания (± В%) необходимо выбирать минимальные (из требований для тестов КО, ОС и Р) значения (обычно это требования для КО), соответствующие им значения остаточного стандартного отклонения S₀, критические значения свободного члена а для теста Р (как имеющего наименьший нижний предел диапазона), а критические значения коэффициента корреляции r рассчитывать из этих величин и реального максимально широкого диапазона (обычно это для ОР). Рассчитанные значения критериев валидации при n = 9 и различных допусках содержания ±В приведены в табл. 2.2 [18].

Таблица 2.2