Сперма. Фізіологія та біохімія сперми

вносять у сперму зра­зу після її отримання, а тоді через 5-10 хв. проводять додатко­ве розрідження сере­довищем № 2.

Рис. 31. Схема технології асептичного взяття, консервування та використання сперми бугаїв (за Ф. І. Осташком):

1 — механічне чучело, 2 — зібрана штучна вагіна, 3 - відділена частина спермоприй-мача з еякулятом, 4 - визначення маси еякуляту, 5 - відділена чохол-пробірка з про­бою сперми, 6 - штатив для фіксації спермоприймача, 7 — відбір проби для мікр-скопування, 9 - пристрій для внесення розріджувача у спермоприймач-змішувач, 10 - перефасування розрідженої сперми в трубку, 11 - автомат ІУЖ для виготовлен­ня облицьованих гранул, 12 — туба, 13 — пристрій для еквілібрації і заморожування сперми, 14- заморожування сперми, 15 і 16- інструменти для осіменіння корів і телиць.

Розливають роз­ріджену сперму у флакони, закривають їх стерильними гу­мовими корками і ви­тримують 4-6 годин у холодильнику при 2-5 °С (еквілібрація). Тоді приступають до заморожування спер­ми за тією чи іншою технологією.

При заморожу­ванні сперми бугая у вигляді гранул на фторопластовій плас­тинці у парі рідко­го азоту занурюють пластинку на 1 хв. у рідкий азот (до при­пинення кипіння азоту), тоді закріплюють її на висоті 2-3 см над поверхнею азоту і за допомогою пластмасового шприца з голкою чи спеціальної крапельниці накрапу­ють сперму у ямки (заглиблення) пластинки по 0,1-0,2 мл (при виготовленні малих концентрованих гранул) чи 0,5-1,0 мл (для великих гранул). Витримують пластинку зі спермою 2-3 хв. над рідким азотом, тоді занурюють її на 1-2 хв. у азот, виймають і згортають гранули охолодженою лопаткою у марлеві мішечки чи контейнери і пере­носять у посудину Дьюара на зберігання. Проте необлицьовані гранули незахищені від мікробного забруднення.

Для одержання облицьованих гранул заповнюють розрідженою спермою поліети­ленову трубку діаметром 3,8^ мм, товщиною стінки 120 мкм, розділяють її за допо­могою автоматичного приладу на окремі дози по 0,25-0,33 мл і загерметизовують їх, охолоджують і заморожують. Потужність запропонованої Ф. І. Осташком технологіч­ної лінії - 2 000 спермодоз за 1 годину (рис. 31).

У 1975 р. Касу (Франція) вперше застосував для фасування сперми бугаїв поліпро­піленові соломинки (пайети) місткістю 0,5 мл. За цією технологією отриману сперму

151

Розділ 4

розріджують середовищем "Леціфос-271" з додаванням 10 % курячого жовтка або се­редовищем "Леціфос Пас-470", розфасовують її під вакуумом у соломинки, кінці яких герметизують полівініловим спиртом або запаюють зварювальним апаратом, марку­ють, витримують 2 години у воді температурою 5 °С і заморожують у парі азоту.

Згодом з'явилася технологія заморожування сперми у мініпайетах об'ємом 0,25 мл, яка дозволила заготовляти від бугая 30-40 тис. спермодоз за рік.

Довший час не вдавалося заморозити сперму кнура, що відзначається великим об'ємом еякуляту, високою чутливістю сперміїв до низьких температур та особливос­тями обміну речовин.

У 1972 р. німецькі дослідники Ріхтер та Лідіке повідомили про успішне замо­рожування сперми кнура. Це надихнуло учених до подальших пошуків і незабаром з'явилася белтсвільська технологія (США), яка, на жаль, виявилася громіздкою, дуже неекономною (з одного еякуляту вдавалося отримати лише одну спермодозу) і тому вона не знайшла практичного застосування.

(Pursel i Jonsori),

(Westendorf ■

{Paquignon i Conrot, 1976)

В даний час у світі користуються чотирма методами заморожування сперми кну­ра: американським {Ригвеї і.}отоп), німецьким (УУехіепсіог/'з співр.,1975), французь­ким - ШКА {Рацищпоп і Сонгоі, 1976) та шведським {Ьагззоп з співр.,1977). Ці мето­дики передбачають еквілібрацію цілого еякуляту чи позбавлених плазми сперміїв при 15 °С; згущення сперми шляхом центрифугування і додавання невеликої кількості розріджувача без гліцерину; додавання решти розріджувача і розрідження сперми до концентрації 400-800 млн/мл та додавання гліцерину при температурі 5 °С; заморо­жування сперми у вигляді гранул на сухому льоді або у соломинках над парою азоту: зберігання сперми в рідкому азоті.

(Almlid

Схематично це собі можна уявити так (Аігшісі з співр.,1987):

• Фільтрування сперми.

• Розрідження трилоновим середовищем до об'єму 180-240 мл.

• Оцінювання концентрації рухливих сперміїв.

• Повільне охолодження до 15 °С.

• Центрифугування 10 хв. при 1900 об/хв.

• Розрідження (лактоза 11 % + жовток 20 %).

• Охолодження 1,5 години до 5 °С.

• Остаточне розрідження (лактоза+жовток+гліцерин 6 %+ паста Огуик 1,5 %).

• Наповнення соломинок (5 мл) спермою.

• Заморожування, 20 хв., 5 см над парою азоту.

• Зберігання у рідкому азоті.

Розморожування такої сперми проводять у водяній бані при температурі 50-52 °С протягом 45-55 секунд.

У дозі сперми для осіменіння розмороженою спермою повинно бути 2-3 млрд рухливих сперміїв.

Не менш складною виявилася проблема заморожування сперми барана. Справа у тому, що у спермі барана немає природного антиоксиданту, що захищав би спермії від

152

Сперма. Фізіологія та біохімія сперми

супероксиду 0₂Н, що утворюється у процесі метаболізму сперміїв і є досить активним окислювачем.

Рис. 32. Посудини Дьюара для стаціонарного збе­рігання сперми: зліва - посудина КВ-6202, решта -посудина АТ-7, "Харків-30", СД-50, СД-20 та АТ-6.

При заморожуванні сперми відбувається перекисне окислення ліпідів, яке руйнує білково-ліпідні комплекси у мембранах спермі­їв і пошкоджує акрозому. Вклю­чення до складу середовища для сперми барана антиоксидантів (ехінохром, коламін, токоферол, ІХФГАН-3) не лише попереджує кріогенні пошкодження, але й під­вищує стійкість сперміїв до хо­лодового удару. На цій основі були запропоновані середовища для заморожування сперми барана - жовтково-сахарозо-хелатоно-гліцеринове з токоферолом (чи ехіно-хромом), лактозо-гуміарабік-тріс-цитратне та інші, розроблені відповідні технології заморожування.

Сперму жеребця для заморожування розріджують лактозо-хелато-цитратно-жовт-ковим середовищем у 5 разів, розфасовують у поліпропіленові трубки місткістю 10 мл, охолоджують і заморожують.

Існує два підходи до заморожування сперми жеребця. Перший з них базується на розрідженні сперми, отриманої на "закриту штучну вагіну", "згущенні" сперміїв шляхом центрифугування з видаленням рідкої частини, додатковому розрідженні їх до бажаної концентрації, одногодинній еквілібрації при +4 °С і заморожуванні в со­ломинках ємністю 4 мл чи 0,5-1 мл або ж у скляних ампулах місткістю 1 мл.

Соломинки зі спермою перед заморожуванням поміщають в охолоджені мідні трубки, які занурюють на 7 хв. у рідкий азот і переносять у посудину Дьюара.

Другий підхід передбачає заморожування лише фракції, багатої сперміями, отри­маної за допомогою "відкритої штучної вагіни" і заморожування її в алюмінієвих ту­бах, що використовуються в косметиці для зубних паст (Віеіашкі, ТізсЬпег, 1979).

Для розморожування сперми, замороженої у вигляді соломинок, поміщають одну дозу сперми (8 соломинок) у водяну баню з температурою 37 °С на 30 сек. і після роз-мороження додають до неї 16 мл розріджувача (без гліцерину), підігрітого до 37 °С.

При використанні для заморожування сперми жеребця великих соломинок - після розморожування у них сперми можна їх використовувати безпосередньо для осіме-:-::ння кобил, з'єднавши соломинку з піпеткою для введення сперми.

Найкращі наслідки осіменіння отримують при проведенні його 12 годин до чи : гцд після овуляції.

Для перевезення сперми у рідкому азоті (-196 °С) користуються спеціальними чи алюмінієвими двостінними посудинами з вакуумно-порошковою або багатошарово-

153

Розділ 4

вакуумною ізоляцією, місткістю від 4 до 50 л рідкого азоту (АТ-6, СДС-20, "Хар-ків-30", "Харків-34А").

Зберігають сперму у племпідприємствах і філіях у спеціальних сховищах чи схо­вищах типу ХБ-0,5, КВ-6202 та ін. (рис. 32).

Для розморожування замороженої в формі гранул сперми переносять її за допо­могою охолодженого пінцета у флакон з 1 мл 2,9 %-го розчину цитрату натрію, попе­редньо підігрітого у водяній бані при температурі 40^42 °С. Через 8-10 сек. виймають флакон зі спермою з водяної бані, оцінюють якість сперми і при рухливості сперміїв не нижче 4 балів сперму використовують для осіменіння.

Розморожування сперми у відкритих гранулах можна проводити і без викорис­тання 2,9 %-го розчину натрію цитрату. Для цього опускають гранулу у тонкостінну стерильну пробірку з випуклим дном, підігріту попередньо 4-5 хв. у водяному тер­мостаті до 38±0,5 °С, і після повного розморожування гранули набирають сперму у піпетку для осіменіння.

Розморожування сперми, замороженої у капілярах (пайетах) проводять у водя­ній бані з дистильованою водою чи розчином фурациліну (1 : 5000) при температурі 38-40 °С, поміщаючи в неї капіляр корком донизу у поліетиленовому мішечку. Потім пайету виймають, протирають марлевою серветкою, відрізають стерильними ножи­цями загерметизовании кінець, перевіряють якість сперми і вставляють в інструмент для осіменіння.

Можна проводити і прискорене двоступінчасте розморожування за допомогою приладу УДС-1.

Відтавання облицьованих гранул також проводять протягом 8-10 сек. у водяній бані з дистильованою водою чи розчином фурациліну (1 : 5000) при температурі 38^-0 °С. Розморожені гранули витирають стерильною серветкою, розрізають ножицями, пере­віряють під мікроскопом і при позитивній оцінці використовують для осіменіння.

Заморожену у вигляді гранул сперму барана розморожують таким чином: засипа­ють у розігрітий водяний чи електричний відтаювач одночасно до 20 гранул і дають можливість стекти розмороженій спермі у стерильний флакон.

Алюмінієві пакети із замороженою спермою жеребця занурюють за допомогою пінцету у водяну баню і легко похитують.

Заморожену у вигляді гранул сперму жеребця насипають одним шаром у стериль­ну конічну колбу і занурюють її у водяну баню.

При роботі з замороженою спермою та рідким азотом необхідно суворо дотриму­ватись техніки безпеки. Перш за все, техніки-оператори повинні працювати з рідким азотом у захисних окулярах та шкіряних рукавицях. Оголені ділянки тіла потрібно надійно захищати одягом.

Посудини Дьюара із замороженою спермою необхідно зберігати у добре вентильо­ваному приміщенні біля вікна, щоб можна було доливати рідкий азот через кватирку. За півгодини до роботи приміщення вентилюють. Заповнюють порожні посудини Дьюа­ра рідким азотом поступово, через гнучкий шланг, опустивши його наконечник до дна посудини. Ні в якому разі при цьому не можна заглядати у горловину посудини.

154

Сперма. Фізіологія та біохімія сперми

У процесі тривалого зберігання рідкого азоту в ньому поступово накопичується кисень (який підтримує горіння), тому через кожних 15-20 заправок зливають у без­печному місці зріджений газ і заповнюють посудину свіжим азотом.

Не можна закривати посудину Дьюара герметично, тому що під впливом випаро­вування рідкого азоту у ній виникає високий тиск, який може зірвати посудину. Не можна також користуватися посудиною Дьюара, горловина та верхня частина якої вкрилася льодом. Один - два рази на рік посудини відігрівають, очищають від домі­шок і дезінфікують.

Питання для самоконтролю

1. Коли утворюється сперма у самця і які структури статевих органів беруть у цьому участь?

2. Які фізіологічні відмінності сперми різних видів тварин?

3. З яких структурних елементів складається спермій і яку роль виконує кожен з них?

4. Які основні особливості хімічного складу сперми?

5. За рахунок яких біохімічних процесів забезпечується рухливість сперміїв?

6. Дайте визначення біозу, гіпобіозу, анабіозу та мезабіозу

7. За якими показниками проводять загальне оцінювання якості еякуляту?

8. За якими показниками проводять мікроскопічне оцінювання сперми? 3. Яка мета розрідження сперми?

'. 0. Яким вимогам повинно відповідати середовище для розрідження сперми? '. 1. Яку роль у складі розріджувача виконують окремі його компоненти? 1 Які існують методи зберігання сперми? Дайте їм порівняльну оцінку. 15. Які небезпеки виникають при заморожуванні сперми і як їх уникнути? 14. Які вимоги техніки безпеки необхідно виконувати при роботі з рідким азотом?

155

5 ТЕХНОЛОГІЯ ШТУЧНОГО

ОСІМЕНІННЯ ТВАРИН © ТА ПТАХІВ

5.1. Методи осіменіння

Введення сперми у статеві органи самок є завершальним і найважливішим етапом роботи у багатоступінчастому ланцюгу заходів з штучного осіменіння тварин. Техні­ка штучного осіменіння тварин розроблена на основі вивчення фізіологічних проце­сів, що відбуваються у статевих органах самки під час природного парування.

Успіх штучного осіменіння залежить від правильного вибору часу осіменіння, від якості та кількості введеної сперми, способу і місця її введення, від дотримання вете­ринарно-санітарних правил у роботі і, безумовно, від фізіологічного стану статевих органів самки.

При виборі оптимального часу осіменіння самки враховують такі обставини:

по-перше, яйцеклітина володіє обмеженою здатністю до запліднення, що вимірю­ється 6-10-ма годинами. Після цього у ній розпочинаються дегенеративні зміни, що збільшують ризик виникнення патологічних відхилень у розвитку зародка чи просто викликають його смерть. Отже, до появи яйцеклітини у яйцепроводі, там уже повинні бути спермії;

по-друге, проникнути у яйцеклітину можуть лише дозрілі (капацитовані) спермії, для чого потрібно 5-6 годин перебування їх у геніталіях самки. Тобто, спермії мають бути введені у статеві органи самки не пізніше, як за 5-6 годин до появи там яйце­клітини;

по-третє, при природному осіменінні спермії зберігають свою живучість у стате­вих органах самки від 24 до 48 годин, тоді як живучість тут сперміїв розрідженої чи заморожено-розмороженої сперми становить близько 12 годин, а тому вводити таку сперму у геніталії самки слід не пізніше, як за 12 годин до очікуваної овуляції.

Овуляція у корів та телиць відбувається через 10-15 годин після закінчення охоти, у 80 % корів - рано-вранці (3-5 година ранку).

Оптимальним часом осіменіння корів та телиць є кінець статевої охоти, а у двох третин корів вона триває лише 12 годин, а тому, якщо вона розпочалася вранці, то осі-

156

Технологія штучного осіменіння тварин та птахів

меняти таких корів слід о 17-19-й годині, якщо ж вона розпочалася ввечері, то таких корів осіменяють вранці наступного дня.

У даний час існує два методи штучного осіменіння:

• поза організмом - застосовується у риб (ікру та молочко змішують у спеціаль­них посудинах і витримують при відповідній температурі);

• у організмі самки - застосовується у всіх видів тварин та птахів у інтрагені-тальній формі (введення сперми у статеві шляхи) чи інтраабдомінальній (введення сперми у черевну порожнину через прокол черевної стінки в напрямку лійки яйце­проводу).

При опрацюванні техніки інтрагенітального штучного осіменіння були запропо­новані такі методи введення сперми:

1. Піхвовий метод - сперму вводять у піхву або на шийку матки без застосуван­ня піхвового дзеркала. Застосовується зараз рідко, лише у молодих овець та телиць з вузькою піхвою та кролиць.

2. Цервікальний метод - сперму вводять безпосередньо у канал шийки матки. Цей метод є основним при осіменінні рогатої худоби.

3. Матковий метод - сперму вводять у порожнину матки.

4. Трубний (яйцепровідний) метод - застосовується у птахів. Довгим катетером через розширювач клоаки сперму вводять у яйцепровід.

При виборі методу штучного осіменіння враховують вид тварини, тип її природ­ного осіменіння та виживання сперміїв у окремих ділянках її статевої системи. Так, велика рогата худоба відноситься до тварин з піхвовим типом природного осіме­ніння, проте, враховуючи погане виживання сперміїв у піхві та несприятливі умови лля проходження їх звідтіль до яйцепроводу (з декількох мільярдів введених спер­міїв досягають яйцепроводу лише кілька десятків тисяч), при штучному осіменінні цих тварин сперму вводять у канал шийки матки, де виживання сперміїв найвище. Піхвовий метод осіменіння застосовують у них, як виняток, у тих випадках, коли неможливо ввести велике піхвове дзеркало у вузьку піхву або коли шийка матки не-;: етатньо розкрита.

У тварин з матковим типом природного осіменіння (коні, свині) при штучному : іменінні сперму вводять у матку, оскільки велика доза сперми, необхідна для цих варйн, не поміститься у шийці матки, а по-друге, сперміям однаково необхідно про­пити у яйцепроводи через матку, тому немає сенсу переміщати їх з природного міс-I^: введення у зворотному напрямку.

Ефективність осіменіння залежить не тільки від місця введення сперми, а й від її ви, тому при застосуванні піхвового методу осіменіння дозу сперми збільшують у 1-3 гази, а при цервікальному, навпаки, зменшують. Слід мати на увазі, що збільшен-^: дози сперми при цервікальному методі осіменіння викликає подразнення нервових елементів шийки матки, внаслідок чого наступає активна гіперемія її слизової оболон­ку: з виходом лейкоцитів, злущуванням епітелію та посиленням м'язових скорочень, —с негативно позначається на виживанні сперміїв та їх запліднюючій здатності.

157

Розділ 5

При всіх методах осіменіння слід дотримуватись таких правил:

• в першу чергу необхідно правильно встановити наявність тічки та охоти у тва­рини і вибрати оптимальний час для осіменіння;

• під час осіменіння слід суворо дотримуватись асептики та антисептики, не до­пустити занесення інфекції у статеві шляхи самки;

• тварину, що осіменяється, необхідно надійно зафіксувати. Найкраще це ро­бити у манежі пункту штучного осіменіння чи відповідно обладнаному стійлі малої ферми;

• перед осіменінням необхідно навести туалет зовнішніх статевих органів сам­ки, старанно обмити їх теплою водою з милом, оросити теплим розчином фурациліну (1 : 5000), витерти насухо тампоном;

• при обробці зовнішніх статевих органів декількох тварин не допускається ко­ристування одним і тим же тампоном (щоб не допустити перенесення збудників за­разних захворювань);

• застосовувані інструменти не повинні бути холодними або гарячими;

• технік-осіменатор повинен працювати у чистому білому халаті, ковпаку або косинці; перед осіменінням кожної тварини старанно мити та дезінфікувати руки;

• доставляти тварину на пункт, її фіксувати та осіменяти слід спокійно, без зайвої грубості, застосування сили та нанесення ударів.