1. Количественные.

1. метод розеткообразования с эритроцитами или моноклональными АТ.

1. использование моноклональных АТ:

• иммунофлюоресценция

• иммунопероксидазный метод

• радиологический анализ

Общее количество популяции В-лимфоцитов оценивается по числу CD 19+ клеток (это надёжный маркер).

1. Функциональные

1. Реакция бласттрансформации (в качестве митогенов используют липополисахариды, в отличие от Т-системы).

1. Определение концентрации сывороточных Ig А, М, G

• Метод радиальной диффузии по Манчини;

• ИФА (определение концентрации Ig Е и D);

• Изучение уровня Ig А и его секреторного компонента в различных смывах с секретах (из слёзных желёз, пазух и др.).

• Определения уровня циркулирующих Ig или комплексов (ЦИК) «АТ-АТ» увеличивается число при аутоиммунных и аллергических процессах

• Выявление аутоантител и криоглобулинов (образуют преципитаты при температуре ниже 37˚С)

Лекция №5 Аг представляющие и фагоцитирующие клетки.

Вспомогательные клетки («А» клетки) по ВОС отличаются от лимфоцитов по ряду свойств и входят в состав клеток мононуклеарной системы фагоцитов.

В неё включены клетки костномозгового происхождения, обладающие подвижностью, способные активно фагоцитировать и прилипать к стеклу.

Мононуклеарные фагоциты:

• циркулирующие моноциты

• макрофаги, локализующиеся в различных органах и тканях

• гигантские эпителиоидные клетки, образующиеся в результате слияния мононуклеарных фагоцитов

Мононуклеарные фагоциты (особенно макрофаги) с В-лимфатическими и дендритными клетками входят в систему АГ представляющих клеток, способны поглощать, перерабатывать и представлять АГ в высокоиммуногенной форме Т-лимфоцитам.

Мононуклеарные фагоциты включены в систему фагоцитирующих клеток вместе с гранулоцитами (микрофагами): (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы).

Моноциты и макрофаги.

Моноциты составляют 5 –10% среди лимфоцитов.

Макрофаги широко распространены в органах и тканях.

Морфология – крупные клетки диаметром 20 – 25 мкм, ядро компактное, округлой формы, в отличие от гранулоцитов (характеризуются полиморфность), макрофаги крупнее, имеют неправильные очертания, полиморфны.

Макрофаги:

• резидентные – постоянно присутствуют в определённых тканях (пример: клетки Купфера в печени, альвеолярные макрофаги и многие другие)

• активированные – подвижные, мобилизуемые в очаги воспаления.

Гигантские эпителиоидные клетки, обнаруживаются в очагах хронического воспаления.

В очагах воспаления могут образовываться гранулёмы с конгломератом клеток, токсинов, не переваренными частицами – являются не функциональными образованьями.

Отличительное свойство мононуклеарных фагоцитов – наличие неспецифической эстеразы.

Имеют широкий набор маркеров и рецепторов.

На поверхности обнаруживается более 50 маркеров и рецепторов. Почти все из них не являются специфическими. Лишь CD 14 – рецептор к ЛПС (липополисахарид), является относительно специфичным для данного ряда клеток.

Основные маркеры:

• рецепторы для Ig в т.ч. Fc для Ig G, так же высокоаффинный CD 64, низкоаффинный CD 16, низкоаффинный к Ig Е CD 23

• рецепторы для компонентов комплемента: С3а, С5а, С3b (CD 116)

• рецепторы для цитокинов: ИФН, ИЛ – 1, 6, ФНО, ФИМ (фактор ингибирующий макрофаги) и др. обеспечивают активное участие в реакциях воспаления

• адгезивные CD 18 и др. обеспечивают адгезию у клеток данного ряда

• углеводные компоненты и простые сахара

• рецепторы для др. БА субстанций: гормонов, нейромедиаторов, гистамина; позволяют участвовать в ряде межклеточных взаимодействий

• АГ ГКГС (HLA) – антигены I и II класса, что позволяет относить их к АГ антиген представляющим клеткам

• CD 14(рецептор для ЛПС); CD 80 и CD 86 – для взаимодействия с CD 28 – при формировании иммунного ответа.

Онтогенез моноцитов и макрофагов.

…

Развитие в ККМ подчинено факторам микроокружения и гуморальным механизмам:

• Гранулоцитарно-макрофагальный колонии стимулирующий фактор (КСФ)

• Моноцитарно-макрофагальный КСФ

• ИЛ – 3

Некоторые факторы могут ингибировать развитие клеток моноцитарно-макрофагального ряда, в частности трансформирующий фактор роста – β (ТФР - β).

Процесс трансформации моноцитов в макрофаги сопровождается морфологическими, биохимическими и функциональными изменениями в клетках, сопровождается увеличением их в размерах, усиливающейся организацией внутриклеточных органел, ростом количества лизосомальных ферментов.

Трансформировавшиеся макрофаги не возвращаются в циркулирующую кровь, а элиминируются через слизистые ЖКТ и верхних дыхательных путей.

Биологические функции макрофагов:

1. Фагоцитоз (поглощение и переваривание чужеродных частиц: микроорганизмов, опухолевых клеток, погибших собственных клеток) некоторые АГ не перевариваются полностью из-за незавершённого характера фагоцитоза;

1. Образование факторов иммунной защиты: синтез и секреция биологически активных веществ: цитокинов, компонентов комплемента, ферментов и др.;

2. Обработка антигена: частичное расщепление АГ и связывание его пептидов с молекулами ГКГС II класса (в первую очередь);

3. Презентация антигенного материала Т-хелперам (возможна после обработки АГ и представляется в виде высокомолекулярных пептидов);

4. Участие во внеклеточный цитолизе: макрофаги способны оказывать повреждающее действие на клетки-мишени с помощью секретируемых продуктов и при непосредственном контакте, вызывая СКЦ, АЗКЦ (СКЦ – спонтанная клеточная цитотоксичность, АЗКЦ – антиген зависимая клеточная цитотоксичность);

5. Регуляция иммунного ответа путем выработки цитокинов, простагландинов и др. пептидных факторов.

Активаторы макрофагов:

• бактериальные продукты (ЛПС и др.)

• компоненты комплемента

• цитокины (наиболее активен γ - ИФН)

• иммунные комплексы

• прилипание к различным поверхностям (широко используется в трансплантологии, диагностики абсцессов лёгких, острых воспалений и др.).

Отличительные признаки активированных макрофагов:

1. большие размеры;

2. повышение адгезивной способности;

3. повышение фагоцитарной активности и эффективности фагоцитоза;

4. усиление синтеза и секреции лизосомальных ферментов, цитокинов и др. биологически активных молекул;

5. усиление "кислородного взрыва", накопление свободных радикалов, перекисей, окислов азота и др. продуктов;

6. повышение экспрессии различных рецепторов (ГКГС II класса; к цитокинам ИЛ-1,2,6, ФНО; трансферрину и др.);

7. повышение способности обрабатывать АГ и представлять его Т-клеткам

8. усиление цитотоксической активности

Способность к фагоцитозу.

Основные стадии фагоцитоза:

Хемотаксис –

п роисходит сближение фагоцита и объекта фагоцитоза определяемое градиентом химических факторов (хемотаксины: бактериальные агенты, компоненты комплемента, хемокины, цитокин ИЛ –8).

При появлении хемотаксина в кровотоке происходит быстрая активация моноцитов, в результате возникает опасность шока, в т.ч. ДВС синдрома или симптомы шокового лёгкого (респираторный дестресс синдром).

Прилипание (адгезия) –

у становление контакта между фагоцитом и объектом фагоцитоза, по средствам опсонинов и молекул адргезии.

Опсонизация – адсорбция опсонинов на поверхности бактериальной клетки и корпускулярных АТ, облегчающих фагоцитирование этих объектов.

Опсонины облегчают фагоцитоз (Ig, компоненты комплемента, фибронектин).

С помощью АТ – осуществляется иммунная опсонизация, обусловленная преимущественно АТ.

активация мембраны –

п одготовка клетки к погружению объекта фагоцитоза.

Погружение –

процесс обволакивания объекта фагоцитоза.

Формирование фагосомы –

п роисходит замыкание мембраны и погружение объекта

Формирование фаголизосомы –

п роисходит слияние фагосом и лизосом.

Способствует локальному закислению в фаголизосоме.

В фаголизосоме могут функционировать несколько бактерицидных систем:

1. Кислород зависимая бактерицидность – для неё необходимы метаболические изменения в клетке. Считается, что если поглощение бактериальной клетки не изменяют метаболизм фагоцита, то бактерицидность слабая.

Усиление метаболизма индуцирует процесс окисления глюкозы, что сопрягается с образованием веществ обладающих бактерицидной активностью (перекиси водорода, высокоактивных гидроксильных радикалов, супероксидных анионов). Являются факторами респираторного взрыва.

Бактерицидность усиливается под влиянием галогенов, которые вовлекаются в процесс бактерицидности по средствам фермента – миелопероксидазы.

Особенно важно каталитическое образование синглетного кислорода и других соединений, обладающих высоким деструктивным потенциалом.

2. Кислород не зависимая бактерицидность – осуществляется продуктами азотного метаболизма (окись азота, нитро – радикалы); важная роль при разрушении микобактерий туберкулёза.

Осуществляется по средствам протеаз, липаз и ряда других ферментов, активность которых оптимальна при кислых значениях pH – катионные белки (ЛКБ – лизосомальный катионный белок), лизоцим, лактоферин.

Киллинг и переваривание – расщепление объекта фагоцитоза и его гибель.

В ыброс продуктов деградации - выброс содержимого фаголизосомы из клетки.

Дендритные клетки.

Занимают особое место среди АГ представляющих клеток.

Их количество составляет 0,1 – 0,5%.

По морфологическим признакам – это клетки с отростчатой формой и хорошо развитой цитоплазмой.

Фагоцитарной активности не имеют.

Обладают высокой способностью представлять АГ лимфоцитам.

Высокая степень поверхностной экспрессии HLA - II класса.

Наличие фермента – АТФазы.

Рассматриваются как основная популяция АГ представляющих клеток.

Полиморфноядерные фагоциты (гранулоциты).

В процессе развития преобладают совершенно различные свойства.

Наблюдается общая способность к фагоцитозу.

Нейтрофилы.

Коротко живущая субпопуляция (1 – 2 суток).

Обладают высокой подвижностью, способны к хемотаксису, адгезии, фагоцитозу, секреции БАВ.

Отличительная способность – продукция секреторных компонентов, высвобождаемых во время дегрануляции богатых ферментами гранул за счёт активного белкового синтеза.

Выделяют первичные гранулоциты (азурофильные), содержащие кислые гидролазы, фосфатазы, катионные белки, миелопероксидазу, лизоцим.

Вторичные (специфические), содержащие щелочную фосфотазу, лактоферин, лизоцим.

После высвобождения гранул их содержимое не восстанавливается, регенерация мембраны отсутствует.

Нейтрофилы – первичные клеточные элементы, обнаруживаемые в очаге острого воспаления, при этом в результате стимуляции в течение нескольких секунд происходит респираторный взрыв и накапливается большое количество метаболитов кислорода, направленных на уничтожение чужеродных организмов. При этом возможно повреждение и здоровых тканей.

Вырабатывают не только ферменты, но и некоторые метаболиты в т.ч. арахидоновой кислоты: лейкотриены, простагландины.

На поверхности зрелых нейтрофилов преобладает ряд маркеров: ГКГС – I класса, рецепторы для компонентов комплемента, для CD 3 (CD 11b), рецепторы к хемокинам в т.ч. к ИЛ – 8 и ряду других цитокинов (ИЛ –1, а так же содержится CD 14).

Нарушение функциональной активности или снижение их числа ведёт к развитию гнойно-воспалительных процессов, таких как хронически рецидивирующие гнойные заболевания кожи и подкожной клетчатки; наблюдается склонность к рецидивам и генерализации.

Эозинофилы.

Обладают слабой фагоцитарной активностью.

Содержат высокий уровень гранул.

Основной компонент гранул – главный щелочной белок.

В достаточно высоком титре синтезируют метаболиты арахидоновой кислоты.

Основная функция: цитотоксическая, за счёт бактерицидности и способности к внеклеточному цитолизу.

Их уровень в крови значительно возрастает при паразитарных и глистных инвазиях, онкопроцессах и аллергических заболеваниях.

Эозинофилия не свидетельствует об острой аллергической реакции, а наблюдается при паразитарных и глистных инвазиях, онкопроцессах.

Методы идентификации.

I. Количественные тесты.

Общий анализ крови.

Число CD 14+ клеток (число моноцитов и косвенные данные о нейтрофилах).