Онтогенез т-лимфоцитов костный мозг

П СК

HLA-DR+ обеспечивают специфичность проникновения клеток в тимус и их дальнейшее выживание

Л СК HLA-DR+, CD38+ маркер стадии синтеза повышаются в крови у больных с лейкозами

TdT+ терминальная дезоксинуклеотедилтрансфераза – исчезает с поверхности клеток по мере её созревания. Необходим для встраивания дополнительных нуклеотидных последовательностей в ДНК клетки, что увеличивает структурное разнообразие рецепторов.

------------------------------------------------------------------

ТИМУС

субкортикальная зона

первоначально взаимодействуют с дендритными клетками и макрофагами, а потом в субэпителиальном слое взаимодействуют с эпителиальными клетками няньками. Начинается активная пролиферация Т-лимфоцитов.

CD2+ адгезивный (с эритроцитами барана образует розетки).

CD5+, CD7+ ранние маркеры Т-лимфоцитов, сохраняются постоянно.

- -----------------------------------------------------------------

кортикальная зона

CD1+ кортикальный рецептор.

Появляются дубль положительные клетки CD4+/CD8+

CD3+ постоянный рецептор лимфоцитов. Входит в состав АГ распознающего комплекса и обеспечивает передачу от АГ - сигнала от TCR+ в цитоплазму.

TCR рецептор имеет Ig имеет α и β цепи. V – вариабельные и С – константные домены. Внутри мембранный и цитоплазматический участки.

- -----------------------------------------------------------------

медуллярная зона

CD4+CD8- CD8+CD4-

CD2+, CD3+, TCR+, CD5+, CD6+,

CD7+, CD28+ (CD4+; 50% CD8+),

Fc Ig

CD45 RA+ – Tх0; CD45 RO+ - клетка памяти.

CD25+, CD38+, CD71+, CD95+, HLA-DR+ - маркеры активированных Т-лимфоцитов

CD 28 – у всех CD 4+ у 50% CD 8+ - предохраняет от апоптоза.

Маркеры активации экспрессируют при встрече с митогеном:

CD 25+ - рецептор к ИЛ –2

CD 71+ - рецептор к трансферину

CD 95+ - рецептор индукторного фактора апоптоза – свидетельствует о готовности клетки к апоптозу.

Когда Т-лимфоциты выходят на периферию, то они занимают Т-зоны.

Селекция Т-лимфоцитов

– происходит на границе между кортикальной и медулярным слоем.

1. образование дубль положительных клеток, перестраивание генов TCR.

1. отбор клонов клеток способных распознавать молекулу ГКГС I или II класса (остальные клетки гибнут путём апоптоза).

2. клетки, распознавшие ГКГС I, теряют CD 4 и сохраняют CD 8, иначе те, что распознают ГКГС II,теряют CD 8 и сохраняют CD 4 (положительная селекция).

3. отрицательная селекция: из популяции лимфоцитов (тимоцитов) через процесс апоптоза удаляются клетки способные реагировать с аутоантигеном.

4. оставшиеся от исходной популяции 2-5% покидают тимус и занимают периферические органы и ткани.

На периферии способен реагировать с АГ 1 из 10.000 Т-лимфоцитов (наивных).

Методы идентификации Т-лимфоцитов.

Функциональные и количественные тесты.

Для определения количества Т-лимфоцитов используются несколько методов:

1. метод розеткообразования с эритроцитами барана – устарел.

1. с применением моноклональных АТ.

2. иммунофлюоресценция в т.ч. проточная.

3. цитофлюоресценция.

4. ИФА.

Т-лимфоциты	CD 3 (маркер)	800 - 2200 в 1 мм3	60 – 80%
Т-хелперы	CD 4 (маркер)	500 – 1200 в 1 мм3	30 –50%
ЦТЛ / Т-супрессоры	CD 8 (маркер)	300 – 600 в 1 мм3	20 –25%
В-лимфоциты	CD 19 (маркер)	150 – 600 в 1 мм3	10 –23%
Моноциты / Макрофаги	CD 14 (маркер)	80 – 200 в 1 мм3	6 –13%
NK клетки	CD 16 (маркер)	100 - 600 в 1 мм3	8 – 22%

Функциональные тесты.

Важны т.к. не всегда снижение количества свидетельствует об их функциональной недостаточности и наоборот.

1.РЕАКЦИЯ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ (РБТЛ).

В асептических условиях из вены берется 5 – 10 мл крови в пробирку, содержащую 100 – 200 ЕД. гепарина. Содержимое пробирки осторожно перемешивают и оставляют на 60 мин. в термостате при t 37°С для осаждения эритроцитов, которое может быть ускорено добавлением декстрана, желатина и др. После инкубации в термостате надосадочный спой плазмы, обогащен­ный лейкоцитами, отсасывают в отдельную стерильную про­бирку. Определяют число лейкоцитов в 1 мл. Затем взвесь лейкоцитов разводят питательной средой 199 (содержащей 200 ЕД. пенициллина и 100 ЕД. стрептомицина в 1 мл) таким образом, чтобы в 1 мл содержалось 1.000.000 – 2.000.000 лейкоцитов, 20% аутологичной плазмы и 80% культуральной среды.

Приготовленную лейкоцитарную взвесь разливают в стериль­ные флаконы по 1 мл, добавляют 0,1 мл предварительно оттитрованного аллергена и пропускают газовую смесь, содержащую 5% углекислого газа. Флаконы закрывают пробками и помещают в термостат при t 37°С на 5 – 7 дней. За это время культура лейкоцитов периферической крови освобож­дается от сегментоядерных лейкоцитов, исключая эозинофилы, и содержит преимущественно одноядерные клетки, которые идентифицируются как малые, средние и большие ЛФ, бласты, ретикулярные клетки и макрофаги.

Интенсивность РБТЛ оценивается различными методами.

Морфологический метод заключается в подсчете в окрашен­ном мазке активированных клеток-бластов на 1000 клеток и определении их процентного содержания. Реакция расценивается как положительная, если число активированных клеток составляет не менее 4% от общего числа культивируемых клеток; максимальное число активированных клеток при действии специфического аллергена может достигать 35%.

Изотопный метод позволяет определить общую активность культур лимфоцитов путем подсчета, включенного в клетки, синтезирующие ДНК, меченного ^ЗН-тимидина, добавляемого в культуральную среду.

Достоверность РБТЛ проверяется контрольными исследова­ниями с культурой исследуемых ЛФ без добавления аллергена (для выявления спонтанной Б.л.) и с культурой ЛФ здоровых доноров, инкубируемой с соответствующим аллергеном.

2.