II. Функциональные тесты.

Определение фагоцитарного числа – процент клеток вступивших в фагоцитоз. В качестве объектов фагоцитоза используют частицы латекса или не патогенные штаммы возбудителей (часто стафилококки).

Оценку производят через 30, 60, 90, 120 минут; чаще через 30, 60, 120 минут.

Позволяет оценивать степень завершённости фагоцитоза и фагоцитарный индекс (среднее число бактерий поглощенных клеткой).

Индекс завершённости фагоцитоза (ИЗФ) в норме около 1.

Помогает в диагностике ряда вторичных иммунодефицитов, при длительно заживающих ранах, гнойно-септических осложнениях (хронических).

Тесты оценки бактерицидности.

НСТ – тест – тест восстановления нитросинего тетразолия – отражает направленность кислород зависимой бактерицидности в клетке.

Суть: нейтрофил поглощает НСТ и восстанавливает его в фармозан, выявляющийся в виде гранул темно-синего цвета.

Интенсивность кислородного взрыва можно оценить с помощью хемолюминесценции, позволяя регистрировать кислород зависимую бактерицидность в виде электрических импульсов.

Тесты по определению продукции миелопероксидазы и лизосомальных катионных белков.

НСТ – тест – в норме составляет 8 – 10% (спонтанный), т.к. бывает спонтанный и стимулированный. Стимулируют зимогеном, результаты должны превышать спонтанный, в среднем составляя 70%.

Резкое снижение свидетельствует о низкой бактерицидности.

Показания: миелопероксидазы и ЛКБ –70 – 95%

Фагоцитарное число – 45 – 79%

Функциональное состояние системы фагоцитирующих клеток. Фагоцитарная активность нейтрофилов

Важнейшей характеристикой функции гранулоцитов является оценка их фагоцитарной активности. Ее снижение может быть результатом как недостаточности опсонирующих факторов сыворотки (антител, комплемента), так и дефектов самих клеток (Нарушения двигательной и метаболической активности врожденного или приобретенного характера). Для определения фагоцитарной активности используют стандартные штаммы непатогенных микроорганизмов (например, стафилококки штамма 209, убитые бактериями, или аутофлора больного).

Методика определения фагоцитарной активности нейтрофилов (визуальный способ).

Необходимые материалы и реактивы: микропипетки или пипетки для взятия крови на СОЭ; пробирки стеклянные (лучше силиконизированные) или из пластика; предметные стекла; микроскоп с иммерсией; термостат; свежеприготовленный раствор 5% цитрата натрия; живая суточная культура микроор­ганизмов, например стафилококк штамм 209; оптический стандарт мутности с образцами в 5, 10, и 20 ед., соответ­ствующими 0,5 -, 1- и 2-миллиардной взвеси микроорганизмов.

В пробирку, содержащую 0,1 мл 5% раствора цитрата натрия, вливают 0,2 мл капиллярной крови и добавляют 0,1 мл 2-миллиардной взвеси микроорганизмов. Инкубируют 30 мин при 37°С. Из взвеси клеток и микроорганизмов делают мазки, оставшуюся взвесь продолжают инкубировать еще в течение 1 ч и снова делают мазки. Мазки фиксируют смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Под микроскопом просматривают 100 нейтрофилов, определяют количество поглощенных микробов.

Оценка фагоцитоза in vitro производится в соответствии фазами реакции: через 30 мин и 2 часа. Поглотительная способность клеток оценивается по двум показателям: процент фагоцитоза, количество фагоцитов на 100 нейтрофилов через 30 мин и 2 часа инкубации (в процентах), ФИ – среднее число микробов на 1 фагоцит через 30 мин и 2 часа инкубации. О последней фазе фагоцитоза – переваривании – судят по коэф­фициентам процента фагоцитоза и ФИ (отношение соответствующих показателей, изученных через 2 часа контакта, к тем же показателям через 30 мин). Фагоцитоз считается за­вершенным при коэффициентах менее 1.

НСТ – ТЕСТ

Тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) используется для выявления так называемых активированных гранулоцитов и моноцитов. В основе активации фагоцитов лежит резкое усиление окислительных реакций. К числу индикаторов этого явления относится реакция с нитросиним тетразолием: поглощенный из раствора, он под влиянием окислительных процессов в клетке превращается в нерастворимый формазан. Последний определяется в клетке в виде темно-синих гранул.

Различают спонтанный и стимулированный НСТ-тест. Результаты спонтанного теста указывают на количество активированных клеток в крови больного, например под влиянием инфекции. Результаты стимулированного теста дают представ­ление о способности исследуемых нейтрофилов к активации in vitro. Этот тест следует проводить при сниженном числе спонтанных НСТ-положительных клеток у больного с бакте­риальной инфекцией, чтобы выявить наличие или отсутствие дефекта окислительного метаболизма.