14.3.2 Оформление результатов опыта

Полученные результаты записывают в таблицу 29.

Таблица 29

Исследуемый продукт	Навеска, г	Объем элюата каротина, мл	Массовая концентрация каротина по графику, мкг/мл	Массовая доля каротина, %

14.4 Контрольные вопросы

1. К какой группе витаминов относится каротин?

2. В каких процессах принимают участие каротиноиды?

3. Какие продукты богаты каротиноидами?

4. Почему β -каротин называют провитамином А?

Рекомендуемая литература

[2 с.234-243];[3 с.513-521]

Лабораторная работа №15 Определение витаминов а и е методом оф вжх

15.1 Цель работы: освоение методов определения жирорастворимых витаминов методом ВЖХ на хроматографе «Милихром».

15.2 Общие сведения

В жизнедеятельности животных и человека биохимическая роль витамина А исключительно велика.

Производные окисления ретинола выступают в качестве фоточувствительных пигментов сетчатки глаз и трансформаторами световой энергии в химическую, которая через нервную систему в определенных участках мозга вызывает оптическую чувствительность. Ретинол тесно связан с минеральным, углеводным, аминокислотным и белковым обменом. Суточная потребность витамина А количественно на 1 кг веса человека составляет 6 мкг ретинола.

Витамин А растворим в жирах и жирорастворителях, устойчив к тепловой обработке, но чувствителен к свету. Витамин А разрушается при окислении и прогоркании жиров.

Недостаток витамина Е вызывает бесплодие, нарушает деятельность желез внутренней секреции. Витамин Е связан с дыхание организма и окислением липидов, а также регулирует синтез витамина А. Витамин Е растворим в жирах и жирорастворителях. Устойчив к нагреванию и кислотам, чувствителен к ультрафиолетовым лучам.

Витамин Е используется как оксидант для стабилизации продуктов питания. Он связывает кислород, соли при этом разрушаются, но предотвращает окисление продуктов.

15.3 Практическая часть

Сущность метода заключается в экстракции витаминов А (ретинола ацетат) и Е (α-токоферола ацетат) изопропиловым спиртом и последующем анализе содержания витаминов с использованием метода обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Приборы и реактивы: хроматограф жидкостной микроколоночный «Милихром»; весы; насос водостройный; баня водяная; колбы конические на 25 и 50 мл; пипетки мерные; колбы мерные на 25 и 50 мл; воронки; холодильник; ретинола ацетат; витамин – Е ацетат; спирт изопропиловый; спирт пропиловый; ацетонитрил.

15.3.1 Методика выполнения работы

Из пробы берут навеску на аналитических весах, помещают навеску в коническую колбу со шлифом емкостью 50 мл и приливают раствор для экстракции (двухкомпонентный экстрагент состава: изопропиловый спирт и дистиллированная вода в объемном соотношении 97:3) в соответствии с таблицей 30.

Таблица 30

Содержание витамина А в объекте мкг/г	Содержание витамина Е в объекте мкг/г	Масса навески, г	Объем экстрагента, см3
40-100	50-100	10	20
100-200	100-500	5	15
2000-6000	500-1000	2	10

Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при температуре (75-+1)^о в течение 10 минут. Колбу с экстрактом отсоединяют от обратного холодильника, закрывают притертой пробкой, охлаждают под струей воды до комнатной температуры и фильтруют через фильтр ПОР-16 с размером пор 10-16 мкм с использованием водоструйного вакуумного насоса.

Фильтрат собирают в мерную колбу вместимостью25 мл. Коническую колбу и осадок на фильтрате тщательно промывают два-три раза небольшими порциями (2-3см³) изопропилового спирта. Раствор в мерной колбе доводят до метки изопропиловым спиртом, тщательно перемешивают и хроматографируют.

Для определения содержания витаминов А и Е проводят две экстракции и каждый экстракт хроматографируют два раза. Находят среднее арифметическое значение высоты пиков, выраженное в единицах оптической плотности или в мм, по градуировочному графику определяют содержание витаминов А и Е в международных единицах (МЕ) и в миллиграммах, соответственно.

Построение градуировочных графиков.

Для приготовления стандартного раствора берут навеску препарата витамина А для получения раствора с активностью 30000 МЕ в 50 мл, навеску помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в изопропиловом спирте и доводят этим спиртом до метки.

Раствор хранят 1 неделю в холодильнике. Из этого раствора готовят рабочие растворы, содержащие 120, 300, 600, 1200,3000, 6000, 12000 МЕ витамина А в 25 мл.

Для этого берут соответственно 0,2;0,5;1,0;2,0;5,0;10,0;20,0 мл основного раствора, помещают в мерные колбы на 25 мл и доводят до метки изопропиловым спиртом.

Полученные рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе «Милихром» при следующих условиях:

• хроматографическая колонка 2х64 (2х80)мм;

• сорбент – Силасорб С18, Сепарон С18;

• трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;

• объем пробы – 6 мм³;

• длина волны 328 нм;

• постоянная времени – 0,2 с;

• скорость передачи элюента – 150 мм³/мин.

Удерживаемый объем пика витамина А составляет 300-360мм³.

Значение средних высот хроматографических пиков, выраженных в единицах оптической плотности, откладывают по оси ординат график, а по оси абсцисс – значение активности витамина А в 25 мл раствора.

Навеску витамина Е – ацетата стандарта 0,02 г растворяют в изопропиловом спирте в мерной колбе на 50 мл, доводят объем до метки этим же спиртом. Получают основной раствор витамина Е с концентрацией 0,4 мг/мл.

Из полученного основного раствора готовят рабочие растворы, содержащие7;5;3;1;0,5;0,1 и 0,05 мг витамина Е в 25 мл раствора.

Для этого соответственно 17,5;12,5;7,5;2,5;2,25;1,25;0,25;0,125 мл основного раствора помещают в мерные колбы на 25 мл и доводят объем до метки изопропиловым спиртом. Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:

• хроматографическая колонка 2х64(2х80)мм;

• сорбент Силасорб С18, Сипарон С18;

• трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;

• объем пробы 6 мм³;

• длина волны – 286 нм;

• скорость подачи элюента 100 мм³/мин;

• постоянная времени – 0,2 с.

Удерживаемый объем пика витамина Е составляет 540-660 мм³.

Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности или мм) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс – значение активности витамина Е в мг в 25 мл раствора.

Содержание витаминов А (Х_А), Е(Х_Е), МЕ/г или мкг/г определяют по формуле:

Х_А(Х_Е)= ,

где С_А, С_Е – содержание витаминов А, Е, найденное по градуировочному графику, соответственно МЕ, мкг;

m – масса навески, г.

Результат вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.