5.3 Практическая часть
5.3.1 Опыт 1. Цветные реакции на белки
Цветные реакции характерны для определенных группировок или для боковых радикалов тех или иных аминокислот.
Биуретовая реакция (реакция Пиотровского)
Биуретовая реакция обусловлена наличием в соединениях пептидной группировки (-CO-NH-). Эту цветную реакцию с солями меди в щелочной среде дают биурет, амиды, и имиды кислот, пептиды, пептоны и белки. Образующиеся окрашенные соединения являются комплексами. Схематично реакцию можно представить следующим образом:
Окрашенный биуретовый комплекс
Цвет комплекса, получаемый при биуретовой реакции с разными пептидами, несколько различен и зависит от длины пептидной цепи. Пептиды с длиной цепи от четырех аминокислотных остатков и выше образуют красный комплекс, трипептиды – фиолетовый, дипептиды – синий.
Ксантопротеиновая реакция (реакция Мульдера)
Эта цветная реакция на белки обусловлена образованием нитропроизводных ароматических и некоторых гетероциклических радикалов. При взаимодействии белка с азотной кислотой происходит нитрование ядра ароматических аминокислот, содержащихся в белке, с образованием окрашенных соединений. Таким образом, с помощью ксантопротеиновой реакции в составе белка можно обнаружить такие циклические аминокислоты, как фенилаланин, тирозин, триптофан и другие.
Реакция протекает по следующей схеме:
Белок, содержащий в своем составе серу, при нагревании с раствором щелочи(гидролизуется), сера отщепляется в виде сероводорода, который тут же превращается в сульфид натрия. Таким образом, для обнаружения серы в белках требуется разрушение белковой молекулы. Отщепляющуюся серу можно определить с помощью уксуснокислого свинца, который реагирует с сульфидом, образуя черный осадок сернистого свинца.
(
CH3COO)2Pb
+ Na2S
2 CH3COONa
+ PbS
Если количество серы в белке незначительно, вместо осадка образуется коричневый раствор.
Реакция обусловлена присутствием в белке серосодержащих аминокислот: цистина, цистеина, метионина.
Приборы и реактивы: пробирки; пипетки; спиртовки; 10%-ный раствор гидроксида натрия; 0,5%-ный раствор сульфат меди; концентрированная азотная кислота; концентрированный гидроксид аммония; 0,5%-ный раствор уксуснокислого свинца.
Приготовление белковых растворов:
Белок куриного яйца: 10 мл яичного белка растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
Белки растительного происхождения: муку злаковых или бобовых массой 3-5 г вносят в коническую колбу, добавляют 30 мл 10%-ного раствора сульфата аммония, перемешивают и настаивают 30 минут при комнатной температуре. Затем фильтруют через бумажный фильтр; фильтрат используют в качестве раствора белка.
5.3.1.1 Методика выполнения работы
В две пробирки наливают по 1 мл растворов яичного и растительного белка. В каждую пробирку добавляют равный объем 10%-ного раствора гидроксида натрия и 2-3 капли 0,5%-ного раствора медного купороса. Отмечают окраску в пробирках.
В две пробирки наливают по 1 мл растворов яичного и растительного белков и в каждую пробирку добавляют по 5 капель концентрированной азотной кислоты. В пробирках выпадает осадок. Содержимое пробирок осторожно нагревают, все время перемешивая. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в желтый цвет, если белок содержит ароматические аминокислоты. Охладив смесь, осторожно, по каплям, добавляют избыток гидроксида аммония. При этом желтая окраска раствора переходит в оранжевую.
В две пробирки наливают по 1 мл растворов яичного и растительного белков. В каждую пробирку добавляют двойной объем 10%-ного раствора гидроксида натрия. Содержимое пробирок перемешивают и осторожно кипятят в течение 1-2 минут. Затем в каждую пробирку приливают по 1 мл раствора уксуснокислого свинца и вновь нагревают. Наблюдают за изменением окраски раствора в пробирках.