65.Проблемы генотерапии. Значение генетической инженерии для решения задач биотехнологии, сельского хозяйства, медицины и различных отраслей народного хозяйства.

Первая успешная попытка применить генотерапию в клинической практике была предпринята в 1990 г. в США. Ребенку, страдающему тяжелым комбинированным иммунодефицитом, связанным с дефектом гена, кодирующего аденозиндезаминазу, была введена неповрежденная копия гена. Извлеченные у больного клетки (Т-лимфоциты крови) культивировали в пробирке, при помощи ретровирусного вектора вводили неповрежденный ген аденозиндезами- назы и возвращали клетки больному.

Другая группа болезней, для которой существуют хорошие перспективы излечения генно-инженерными методами, — лизосомные болезни накопления.

На сегодняшний день поддаются излечению с помощью трансгенеза уже около 10 болезней человека.

К числу важных практических достижений генной инженерии следует также отнести создание диагностических препаратов. На сегодняшний день в медицинскую практику введено более 200 новых диагностикумов.

Использование методов генетической инженерии для изучения проблем генетики и биологических наук.

Развитие ряда новых методических приемов привело к расширению возможностей генетической инженерии на клеточном уровне. Определяющую роль сыграл метод гибридизации соматических клеток.

В 1960 г. Ж. Барский показал, что соматические клетки животных способны сливаться и объединять генетическую информацию двух родительских клеток. В 1965 г. Г. Харрис обнаружил, что частота гибридизации соматических клеток резко повышается при введении в смесь клеток частиц РНК-содержащего вируса парагриппа типа Сендай, инактивированного ультрафиолетовым светом. Под влиянием частиц вируса происходит слипание клеток и их последующее слияние друг с другом. Оказалось, что в таких условиях возможна гибридизация клеток, происходящих от далеких форм, таких, как клетки крысы и мыши, мыши и человека, раковой клетки и нормальной клетки человека и т. д.

Эксперименты по слиянию клеток коснулись и мира растений. Оказалось возможным получать протопласты клеток растений, обрабатывая в гипертонической среде клетки мезофилла ферментами пектиназой и целлюлазой, действующими на соединительные части листа и клеточные оболочки. В гипертонической среде протопласты клеток растений выглядят как зеленые сферические образования, отделенные от окружающей среды только цитоплазматической мембраной. Эта модель сразу же привлекла к себе пристальное внимание как уникальный материал для изучения генетики растений. Несмотря на то, что культура тканей была разработана задолго до открытия способа культивирования изолированных протопластов, преимущества последней модели очевидны. Протопласты могут быть с высокой эффективностью клонированы на чашках Петри, что открывает подходы в селекции растений с использованием методов генетики микроорганизмов. Для некоторых видов растений (табак„ морковь, томат и др.) из отдельного протопласта после регенерации клеточной оболочки и образования каллуса возможно формирование целого растения

Подобно животным клеткам, обработанным инактивированным вирусом Сеида, протопласты растительных клеток также способны к слиянию. В данном случае в качестве индуктора выступают азотнокислый натрий, полиэтиленгликоль и другие соединения. Однако растительные модели от животных отличает принципиальная возможность клонирования целого растения с суммой признаков родителей из слившихся в единый протопласт двух партнеров по гибридизации. При слиянии клеток разных видов получены соматические, или парасексуальные, гибриды. Для генетической инженерии растительных клеток этот путь открывает большие перспективы.

Клеточный и организменный уровни тесно взаимообусловлены. В текущей время интенсивно разрабатываются методы искусственного оплодотворения яйцеклеток млекопитающих и человека в пробирке и выращивания в этих условиях эмбриона. В модельных опытах с клетками животных стало возможным переносить ядро из одной клетки в другую, обеспечивать слияние в одно целое двух или нескольких эмбрионов на разных стадиях развития, дробить их на два или большее число, включать посторонние клетки в эмбрион и т. д.

Для генетической инженерии на уровне организмов большой интерес представляют случаи получения аллофенных мышей, т. е. особей, содержащих генотипически разные ткани, произошедшие из клеток, полученных от разных родителей. Такие особи с генотипически разнокачественными тканями возникают при вмешательстве на самых ранних стадиях развития. Рождающийся мышонок является аллофенным, он несет ткани от разных родителей, т. е. объединяет их фенотипы. Можне получить аллофенные особи от трех, четырех и большего числа родителей. Аллофенные мыши, составленные из клеток даже гистонесовместимых родителей, развиваются нормально, без иммунных нарушений. Это показывает, что иммунологическая толерантность не просто выражение генотипа животного, она является итогом развития.

Большие перспективы открывает внесение ядра соматических клеток в безъядерные яйцеклетки. Дж. Гердон в 1962 г. в опытах с амфибией Xenopus laevis показал, что пересадка ядра из клеток кишечного эпителия головастиков в яйцеклетки, в которых ядро было убито ультрафиолетовым светом, дает полноценно развитых особей.

В принципе при пересадке в безъядерные яйцеклетки ядер из соматических клеток одной и той же особи мы имеем метод получения клона генотипически тождественных особей. При осуществлении таких приемов для млекопитающих они могут приобрести важнейшее практическое значение. В стадах популяциях крупного рогатого скота, овец и других животных встречаются генотипически уникальные животные особенно высокой продуктивности: с большими удоями молока, густотой и длиной шерсти и т. д. Методами селекции их генотип в целом из-за расщепления не воспроизводим в потомстве. Клонирование посредством пересадки ядер из соматических клеток таких особей, учитывая возможность получения практически неограниченного количества ядер от одного животного, в безъядерные яйцеклетки открыло бы путь к колоссальному повышению производительности в сельском хозяйстве.

Новые возможности для изучения взаимодействия ядра с цитоплазмой на уровне соматических клеток дает метод реконструкции клеток млекопитающих после соединения ядра и цитоплазмы из разных источников. Клетки разделялись на ядро (кариопласт) и на цитоплазму (цитопласт) в присутствии цитохолазина. Меченный ~Н-тимидином кариопласт с помощью инактивированного вируса Сендай был введен в цитопласт. Такие реконструированные клетки размножались.

Разработка методов микрохирургии яйцеклеток создала возможность клонирования млекопитающих. Удаление одного пронуклеуса из оплодотворенного яйца позволило осуществить развитие на базе генома оставшегося гаплоидного пронуклеуса. После удвоениянабора появляются полностью гомозиготные особи. Поскольку такими особями могут быть только самки, так как особи с половыми хромосомами — УУ — погибают, обычное половое размножение при получении клона невозможно. Клонирование может быть достигнуто лишь при повторении процедуры удаления из оплодотворенной яйцеклетки мужского пронуклеуса. Повторяя эту процедуру у потомков, можно получить группу особей, идентичных друг другу по генотипу, подлинно гомозиготных, повторяющих генотип исходного материнского генома, т. е. образовать клон из особей млекопитающих.