48.Системы рестрикции и модификации. Рестрикционные эндонуклеазы.

РЕСТРИКЦИЯ И МОДИФИКАЦИЯ ДНК (от позднелат. restrictio-ограничение и modificatio- видоизменение), специфич. р-ции метаболизма ДНК в клетках бактерий, обеспечивающие защиту собственной ДНК от встраивания в нее последовательностей ДНК чужеродного происхождения.

Функционирование систем Р. и м. ДНК (сокращенно Р.) основано на след. принципах. С помощью ферментативных р-ций собств. клеточная ДНК специфич. образом модифицируется так, что рестриктазы оказываются по отношению к этой ДНК неактивными. Любая вторгающаяся в клетку чужеродная ДНК отличается от резидентной (собственной) ДНК по специфичности модификации. Это делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестриктаз; разрушению ("рестрикции") подвергаются те молекулы ДНК, к-рые не содержат соответствующих модифицир. элементов.

Т. обр., благодаря системе Р. возможность функционирования чужеродной ДНК в клетке и ее рекомбинации с собств. клеточной ДНК (см. Рекомбинация генетическая)сведены к минимуму.

Известно неск. бактериальных систем Р. Наиб. хорошо изучены аллельные системы К и В (разл. структурные состояния гена), определяющие специфичность резидентной ДНК у штаммов Escherichia coli (E. coli), а также неаллель-ные системы RI и RII, генетич. информацию для к-рых несут плазмиды. Подобные системы в клетках животных пока не обнаружены.

В большинстве систем модификация осуществляется метилированием N6-аминогруппы остатков аденина в составе тех или иных специфич. участков ДНК с образованием 6-метиламинопурина. Возможны и др. варианты хим. модификации ДНК, осуществляемой компонентами подобных систем. Напр., в системе EcoRII метилируется атом С-5 остатков цитозина, а при контролируемой клеткой-хозяином модификации ДНК Т-четных фагов (инфицируют Е. coli) происходит глюкозилирование остатков гидроксиме-тилцитозина, присутствующего в ДНК этих фагов. Ф-ции рестрикции обусловлены эндонуклеазной активностью рестриктаз, к-рые узнают специфич. последовательности ДНК при условии, что эти последовательности не модифицированы. Фермент катализирует разрыв фосфодиэфирной связи в каждой из двух цепей ДНК вблизи этой последовательности или в др. местах молекулы, что определяется типом фермента. Двухцепочечные разрывы стимулируют дальнейшее интенсивное неспецифич. разрушение ДНК др. нуклеазами.

Р. осуществляются только в отношении двухцепочечных молекул ДНК. Одноцепочечные ДНК нек-рых фагов модифицируются или подвергаются рестрикции только тогда, когда они находятся в фазе репликации. В то же время для обеспечения устойчивости к рестриктазам достаточно модификации только одной из цепей ДНК. По этой причине ДНК; образующаяся в ходе полуконсервативной репликации, защищена от действия собств. клеточных рестриктаз благодаря модификации матричной цепи.

В. Арбер доказал, что в бактериях действуют специальные ферменты, способные специфично отличать свою ДНК от чужой. Эти ферменты рестрицируют (т.е. ограничивают) возможность размножения фаговой ДНК в бактериях путем ее более или менее специфичной деградации. Такие ферменты были названы эндонуклеазами рестрикции или рестриктазами . Естественной функцией рестриктаз является защита бактерии от инфекции вирусами. ДНК в сайтах рестрикции у самой бактерии модифицирована метилированием, так что фермент рестрикции не может порезать свою собственную ДНК. Однако вирусная ДНК не защищена, и ферменты ее расщепляют .Первая рестриктаза, специфично расщепляющая двухцепочечную ДНК в строго определенных сайтах, была выделена Г. Смитом Известны три класса рестриктаз. В генно-инженерных работах используют ферменты второго класса, разрывающие двухцепочечную ДНК в зоне участка узнавания. Обычно фермент распознает специфичную последовательность из 4-6 п.н., являющуюся палиндромом разрезает ее в середине или несколько в стороне. В последнем случае образуются выступающие одноцепочечные концы, получившие название "липких". Такие концы, сформировавшиеся под действием одной и той же рестриктазы могут гибридизоваться между собой в силу комплементарности оснований. Эта способность обеспечивает возможность объединения различных молекул ДНК. В настоящее время известно более 400 рестриктаз, способных расщеплять ДНК в общей сложности по почти 120 различающимся последовательностям.