- •Колот Наталья Владимировна
- •Компенсация углеводного обмена у кроликов с экспериментальным сахарным диабетом 1 типа при трансплантации островков поджелудочной железы в разные сайты организма
- •Содержание
- •Введение
- •Раздел I
- •1.1. Современные представления о физиологии поджелудочной железы и её роли в жизнедеятельности организма.
- •1.1.1. Эмбриональное становление поджелудочной железы.
- •1.1.2. Инсулин, регуляция его синтеза и секреции.
- •1.1.3. Физиологические эффекты инсулина в организме.
- •1.2. Cахарный диабет 1 типа.
- •1.3. Трансплантация островков поджелудочной железы как метод лечения сахарного диабета 1 типа.
- •1.4. Выживание островков поджелудочной железы в различных сайтах организма.
- •Раздел II
- •2.1. Получение островков поджелудочной железы.
- •2.2. Разделение суспензии клеток и островков поджелудочной железы в градиенте плотности фиколла.
- •2.3. Культивирование островков поджелудочной железы.
- •2.4. Выявление β-клеток островков поджелудочной железы с помощью специфической реакции на дитизон.
- •2.5. Определение базального и стимулированного уровня инсулина в среде культивирования.
- •2.6. Измерение активности α - амилазы в среде культивирования островков поджелудочной железы.
- •2.7. Экспериментальная модель сахарного диабета.
- •2.8. Трансплантация островков поджелудочной железы животным с экспериментальным сд 1 типа.
- •Экспериментальные группы животных:
- •2.9.1. Определение содержания глюкозы в цельной крови.
- •2.11. Определение уровня инсулина в сыворотке крови.
- •2.12. Определение уровня с-пептида в сыворотке крови.
- •2.13. Измерение биохимических показателей в сыворотке крови экспериментальных животных.
- •2.14. Определение показателей крови у экспериментальных животных.
- •2.15. Гистологический анализ образцов.
- •2.16. Реактивы.
- •2.17. Статистическая обработка результатов.
- •3.1. Изучение структурно - функциональных свойств островков поджелудочной железы неонатальных поросят и кроликов in vitro
- •3.3. Использование флуоресцентного красителя DiОc18 для идентификации трансплантата островков поджелудочной железы.
- •3.4. Изучение влияния ксенотрансплантации островков поджелудочной железы интрапортально и внутриселезеночно на функцию печени и селезенки
- •3.4.1. Влияние интрапортальной ксенотрансплантации островков поджелудочной железы на функциональное состояние печени
- •3.4.2. Влияние внутриселезеночной ксенотрансплантации островков поджелудочной железы на функциональное состояние селезенки
- •Заключение
- •Список использованной литературы
Раздел II
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Все экспериментальные манипуляции с животными проводили в соответствии с положениями «Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985) и национальными нормами по биоэтике (I национальный конгресс по биоэтике, Киев 2001).
Экспериментальная работа была выполнена на ОПЖ неонатальных кроликов породы шиншилла (60 штук) и ОПЖ неонатальных поросят первого поколения пород крупная белая и украинская мясная (160 штук), доставленных с Агрокомплекса «Слобожанский» Харьковской области, Чугуевского района, с. Граково. В качестве реципиентов для трансплантации ОПЖ были использованы половозрелые самцы кроликов возрастом 5-6 месяцев, массой 2,5-3,0 кг (130 штук), содержащиеся в условиях вивария ИПКиК.
2.1. Получение островков поджелудочной железы.
Экстирпацию хвостовой части ПЖ проводили в стерильных условиях с соблюдением всех норм асептики и антисептики.
Неонатальных поросят и неонатальных кроликов после предварительного легкого эфирного наркоза забивали гильотированием. Хвостовую часть ПЖ после выделения помещали в охлажденный стерильный раствор Хэнкса, содержащий 0,25% БСА, 10 мМ Hepes и антибиотики (75 мкг/мл канамицина и 100 Ед/мл бензилпенициллина натриевой соли), в котором производили измельчение панкреатической ткани на фрагменты размером 2-3 мм3, отмывали от крови 3-4 раза этим же раствором. Затем инкубировали в течение 15 минут при 37°С в растворе Хэнкса, который содержал 2,5 мг/мл коллагеназы типа IA, дважды отмывали раствором Хэнкса, который содержал 0,25% БСА, 10 мМ Hepes, антибиотики и фильтровали через нейлоновую сетку с диаметром ячеек >200 мкм. Полученная суспензия содержала как одиночные клетки, так и ОПЖ в количестве 2-6 х 105 островков/мл.
2.2. Разделение суспензии клеток и островков поджелудочной железы в градиенте плотности фиколла.
Полученные 3 мл суспензии клеток и ОПЖ наслаивали на ступенчатый градиент плотности фиколла (1,040, 1,080, 1,089, 1,094, 1,100 г/см3) и подвергали центрифугированию в течение 12 минут при 225g. Затем в стерильных условиях отбирали образовавшиеся при разделении фракции и осадок клеток, затем в чистых стерильных пробирках дважды отмывали от фиколла средой 199 с антибиотиками.
2.3. Культивирование островков поджелудочной железы.
Культивирование проводили по методу, разработанному Korbutt G.S. и соавторами [211], в атмосфере, содержащей 5% СО2, при 37°С с использованием питательной среды, приготовленной на основе среды 199 с добавлением 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,5% БСА, 10 мМ глюкозы, 2 мМ глутамина и антибиотиков. На дно чашки Петри помещали покровное стекло, наносили 200 мкл полученной при разделении в градиенте фиколла суспензии клеток и островков, оставляя в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 30 минут, затем добавляли 2 мл среды для культивирования ОПЖ. Культивирование осуществляли в течение 8-ми суток. Через каждые двое суток забирали чашки Петри и проводили окраску надосадка и стекла дитизоновым раствором. Морфологические исследования проводили под световым микроскопом при увеличении х 20 и х 40. Микрофотосъёмку осуществляли на микроскопе Olympus XI781.
Каждые сутки отбирали пробы на содержание инсулина и α - амилазы, осуществляли подсчёт количества ОПЖ и определяли жизнеспособность ОПЖ методом суправитального окрашивания 0,1% трипановым синим [71]. Подсчёт количества ОПЖ в отобранной культуральной среде проводили, используя камеру Горяева и световой микроскоп.