Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРИНЫ.docx
Скачиваний:
0
Добавлен:
03.09.2019
Размер:
6.26 Mб
Скачать

Раздел II

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все экспериментальные манипуляции с животными проводили в соответствии с положениями «Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985) и национальными нормами по биоэтике (I национальный конгресс по биоэтике, Киев 2001).

Экспериментальная работа была выполнена на ОПЖ неонатальных кроликов породы шиншилла (60 штук) и ОПЖ неонатальных поросят первого поколения пород крупная белая и украинская мясная (160 штук), доставленных с Агрокомплекса «Слобожанский» Харьковской области, Чугуевского района, с. Граково. В качестве реципиентов для трансплантации ОПЖ были использованы половозрелые самцы кроликов возрастом 5-6 месяцев, массой 2,5-3,0 кг (130 штук), содержащиеся в условиях вивария ИПКиК.

2.1. Получение островков поджелудочной железы.

Экстирпацию хвостовой части ПЖ проводили в стерильных условиях с соблюдением всех норм асептики и антисептики.

Неонатальных поросят и неонатальных кроликов после предварительного легкого эфирного наркоза забивали гильотированием. Хвостовую часть ПЖ после выделения помещали в охлажденный стерильный раствор Хэнкса, содержащий 0,25% БСА, 10 мМ Hepes и антибиотики (75 мкг/мл канамицина и 100 Ед/мл бензилпенициллина натриевой соли), в котором производили измельчение панкреатической ткани на фрагменты размером 2-3 мм3, отмывали от крови 3-4 раза этим же раствором. Затем инкубировали в течение 15 минут при 37°С в растворе Хэнкса, который содержал 2,5 мг/мл коллагеназы типа IA, дважды отмывали раствором Хэнкса, который содержал 0,25% БСА, 10 мМ Hepes, антибиотики и фильтровали через нейлоновую сетку с диаметром ячеек >200 мкм. Полученная суспензия содержала как одиночные клетки, так и ОПЖ в количестве 2-6 х 105 островков/мл.

2.2. Разделение суспензии клеток и островков поджелудочной железы в градиенте плотности фиколла.

Полученные 3 мл суспензии клеток и ОПЖ наслаивали на ступенчатый градиент плотности фиколла (1,040, 1,080, 1,089, 1,094, 1,100 г/см3) и подвергали центрифугированию в течение 12 минут при 225g. Затем в стерильных условиях отбирали образовавшиеся при разделении фракции и осадок клеток, затем в чистых стерильных пробирках дважды отмывали от фиколла средой 199 с антибиотиками.

2.3. Культивирование островков поджелудочной железы.

Культивирование проводили по методу, разработанному Korbutt G.S. и соавторами [211], в атмосфере, содержащей 5% СО2, при 37°С с использованием питательной среды, приготовленной на основе среды 199 с добавлением 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,5% БСА, 10 мМ глюкозы, 2 мМ глутамина и антибиотиков. На дно чашки Петри помещали покровное стекло, наносили 200 мкл полученной при разделении в градиенте фиколла суспензии клеток и островков, оставляя в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 30 минут, затем добавляли 2 мл среды для культивирования ОПЖ. Культивирование осуществляли в течение 8-ми суток. Через каждые двое суток забирали чашки Петри и проводили окраску надосадка и стекла дитизоновым раствором. Морфологические исследования проводили под световым микроскопом при увеличении х 20 и х 40. Микрофотосъёмку осуществляли на микроскопе Olympus XI781.

Каждые сутки отбирали пробы на содержание инсулина и α - амилазы, осуществляли подсчёт количества ОПЖ и определяли жизнеспособность ОПЖ методом суправитального окрашивания 0,1% трипановым синим [71]. Подсчёт количества ОПЖ в отобранной культуральной среде проводили, используя камеру Горяева и световой микроскоп.

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.