Заключение

На сегодня СД по распространенности занимает первое место среди эдокринопатий. Mакро - и микрососудистые осложнения, развивающиеся при СД 1 типа, приводят к ранней инвалидизации и гибели людей [4, 25, 27, 38, 157, 335], а как известно СД 1 типа в основном встречается в детском, юношеском возрасте и среди трудоспособного населения страны.

Применение комбинированной инсулинотерапии, внедрение современных способов введения инсулина и контроля за глюкозой (неинвазивные глюкометры, инсулиновые «помпы»), широкий спектр гипогликемических фармацевтических препаратов при лабильном течении СД 1 типа, для которой характерны резкие колебания гликемии, склонность к гипогликемическим состояниям и кетозу, не позволяют адекватно контролировать гликемию, не предупреждают развитие диабетических осложнений, могут стать причиной развития гипогликемической комы и гибели [10, 47, 55, 67].

Известно, что между железами внутренней секреции, которые продуцируют гормоны, существует сложный механизм саморегуляции, базирующийся на множестве прямых и обратных связей. Следовательно, дефицит инсулина в организме может повлечь за собой развитие нарушений в других эндокринных железах, а длительная инсулинотерапия может приводить к развитию системных гормональных нарушений [10, 27].

Неэффективность заместительной терапии с неизбежностью приводит к поиску более эффективных и физиологических способов коррекции метаболических нарушений и компенсации СД 1 типа, особенно лабильной формы заболевания.

Трансплантация β-клеток или ОПЖ, способных к синтезу и секреции полноценных гормонов, рассматривается как альтернативное и перспективное направление в лечении инсулиновой недостаточности при СД 1 типа, так как гормоны поступают в организм реципиента «по требованию» в ответ на изменение уровня глюкозы в крови [53, 101, 102, 158, 232, 239]. Использование трансплантации ОПЖ является более эффективным, чем одиночных β-клеток. Известно, что структурно-функциональной единицей эндокринной части ПЖ являются островки, которые представляют собой клеточные конгломераты, клетки которых имеют регуляторные взаимоотношения, обеспечивая не только гормонопродукцию трансплантата, а и эффективную эндокринную регуляцию в целом [190, 309].

АлТц ОПЖ, полученных от двух и более доноров, при использовании комбинированной иммуносупрессивной терапии, способствует восстановлению нормогликемии и регуляции углеводного обмена в организме реципиента на протяжении длительного периода времени, обеспечивает снижение доз введения экзогенного инсулина или приводит к полной инсулинонезависимости [293, 329]. Однако использование АлТц ОПЖ в клинике требует решения целого ряда вопросов, к которым относят ограниченный запас аллогенного донорского материала [97, 101, 109, 316], а также некоторые из иммуносупрессивных препаратов являются токсическими для ОПЖ [162].

Необходимо отметить, что КсТц ОПЖ, полученных от неонатальных поросят [2, 179, 273, 316, 323] и неонатальных кроликов [84, 97, 110, 269], по своему эффекту не уступает АлТц, способствуя стабилизации СД 1 типа, нормализации показателей углеводного обмена, а также отдоляет или предупреждает развитие тяжелых диабетических осложнений. Однако трансплантация ОПЖ сталкивается с пока еще нерешенной проблемой развития иммунного ответа на введение графта в организме реципиента [272].

Одним из способов защиты трансплантата от иммунной агрессии иммунокомпетентных клеток реципиента является трансплантация ОПЖ в иммунопривилегированные сайты организма [126, 176, 207].

На сегодняшний день, к сожалению, не обнаружен идеальный сайт для трансплантации ОПЖ. В мировой литературе встречаются данные, касающиеся наличия антидиабетического эффекта ауто -, изо - и аллографтов ОПЖ трансплантированных в пульпу селезенки животных с экспериментальным диабетом [146, 197, 237, 310, 312, 330]. Позитивный эффект на стабилизацию углеводного обмена больных СД был отмечен после АлТц ОПЖ в портальную вену при использовании комбинированной иммуносупрессивной терапии [117, 293]. Стабилизация диабета наблюдалась после АлТц ОПЖ в семенник [156, 256] и в костный мозг [283]. Трансплантация изо - и аллографтов ОПЖ под капсулу почки способствовала длительному поддержанию нормогликемии в организме животных с экспериментальным диабетом [226, 241, 324]. КсТц ОПЖ взрослых свиней животным - реципиентам с экспериментальным диабетом приводила к быстрой потере графта (на 7 сутки) [164, 248], а применение иммуносупрессивной терапии способствовало продлению срока функционирования ксенографта ОПЖ до 53 суток [277].

Следует отметить, что до сих пор не существовало данных касающихся влияния КсТц ОПЖ неонатальных животных в зависимости от места введения на компенсацию экспериментального СД 1 типа. Кроме того, известно, что ОПЖ неонатальных животных являются менее иммуногенным материалом для трансплантации [44, 321], в отличие от использования ОПЖ взрослых животных, и могут длительное время переживать в условиях гипоксии и тепловой ишемии, которые могут возникать при их получении и трансплантации [166, 313].

Обобщая вышеизложенное целесообразно было оценить в сравнительном аспекте влияние АлТц и КсТц ОПЖ неонатальных животных (кролики и поросята) на углеводный обмен и компенсацию СД 1 типа у кроликов с экспериментальным СД 1 типа в зависимости от места введения ОПЖ. В качестве сайтов для трансплантации ОПЖ использовали портальную вену, паренхиму печени, селезёнку, капсулу почки, семенник, костный мозг и внутривенно.

Для изучения влияния трансплантата на углеводный обмен в организме реципиента, необходимо было исследовать в сравнительном аспекте морфо - функциональные особенности ОПЖ неонатальных поросят и неонатальных кроликов in vitro.

Исследование инсулинпродуцирующей способности ОПЖ неонатальных поросят и неонатальных кроликов в условиях in vitro, показало, что ОПЖ двух использованных видов неонатальных животных имеют относительно высокий инсулинпродуцирующий потенциал, который остается практически без существенных изменений на протяжении шести суток культивирования, после чего наблюдается его снижение. Адекватный ответ на стимуляцию глюкозой наблюдался на 8 сутки в культурах ОПЖ двух видов неонатальных животных. Базальный и стимулированный уровень инсулина в культуре ОПЖ неонатальных кроликов превышал в 1,2-1,5 раза содержание инсулина в культуре ОПЖ неонатальных поросят. Содержание α-амилазы в среде культивирование ОПЖ неонатальных животных постепенно снижалось практически до полного исчезновения на 8 сутки, что свидетельствовало о деструкции и самопереваривании ацинарных клеток.

Морфометрический анализ культур ОПЖ животных двух использованных видов показал, что ОПЖ неонатальных кроликов практически полностью прикрепляются ко дну культуральной чашки, а ОПЖ неонатальных поросят остаются свободно флотирующими в питательной среде. Жизнеспособность ОПЖ неонатальных животных на протяжении 6 суток составляла в среднем 77-86%, после чего наблюдалось её снижение.

Проведение гистохимического исследования срезов ПЖ неонатальных поросят позволило идентифицировать ОПЖ в панкреатической ткани, которые содержали дитизонат цинка в виде темно-красной зернистости, что доказывало присутствие инсулина в β-клетках островков.

При выделении в ступенчатом градиенте плотности фиколла ОПЖ из суспензии, полученной из ПЖ неонатальных животных, были установлены некоторые отличия. При разделении суспензии, полученной из ПЖ неонатального кролика, в градиенте плотности фиколла показало образование трех фракций, находящиеся в слоях фиколла с плотностью 1,080, 1,089 и 1,100 г/см³. Разделение суспензии клеток неонатальных поросят также показало образование трех фракций в слоях фиколла с плотностью 1,089, 1,094 и 1,100 г/см³. Микроскопическое исследование показало наличие β-клеток и ОПЖ неонатальных кроликов в слое фиколла с плотностью 1,080-1,089 г/см³, а ОПЖ неонатальных поросят в слое в слое фиколла с плотностью 1,089-1,094 г/см³. Специфическая реакция на инсулин, используемая для идентификации β-клеток, включающая обработку ОПЖ дитизоном, подтвердила наличие ОПЖ неонатальных кроликов и неонатальных поросят в слое фиколла с плотностью 1,080 г/см³ и 1,089 г/см³ соответственно, а одиночных β-клеток неонатальных кроликов и неонатальных поросят в слое фиколла с плотностью 1,089 г/см³ и 1,094 г/см³ соответственно и ацинарных клеток в слое фиколла с плотностью 1,100 г/см³ обоих видов животных.

Проведенный анализ функции ОПЖ in vitro позволил сделать заключение, о возможности использования данного эндокринного материала в качестве трансплантационного материала.

Трансплантацию ОПЖ неонатальных животных проводили на 21 сутки после введения диабетогенной дозы аллоксана, когда у животных наблюдалась стойкая гипергликемия.

Для всестороннего изучения влияния сайта трансплантации ОПЖ на углеводный обмен нами было проведено комплексное исследование показателей углеводного обмена (уровень глюкозы в крови и моче, тест толерантности к глюкозе, уровень HbA1c). Нормогликемия наблюдалась в раннем послеоперационном периоде (7 сутки) после внутриселезеночной АлТц и КсТц ОПЖ, при этом на протяжении 3-4 месяцев уровень глюкозы в крови у этой группы животных не превышал 9 ммоль/л. Уровень глюкозы достигал нормальных значений на 14 сутки после АлТц и КсТц ОПЖ в портальную вену, в паренхиму печени, под капсулу почки, в костный мозг. Трансплантация алло - и ксеногенных ОПЖ в семенник характеризовалась медленным восстановлением нормогликемии (на 20 сутки). После внутривенных АлТц и КсТц ОПЖ нормогликемия достигнута не была на протяжении всего периода наблюдения. Кратковременный гипогликемический эффект наблюдался при АлТц и КсТц ОПЖ в печень, в семенник и под капсулу почки, так на 35-42 сутки, и на 56 сутки после АлТц и КсТц ОПЖ в костный мозг у животных наблюдалось повторное повышение глюкозы в крови. Повышение уровня гликемии после интрапортальной АлТц и КсТц ОПЖ наблюдалось на 49 сутки, однако в течение последующего периода этот показатель не превышал 10-12 ммоль/л.

Динамика глюкозы в моче у экспериментальных животных после АлТц и КсТц ОПЖ в различные сайты организма была подобной изменению гликемии. Следует отметить, что только после внутриселезеночной после АлТц и КсТц ОПЖ у животных – реципиентов глюкоза в моче не обнаруживалась в течение всего периода наблюдения.

Проведение теста толерантности к глюкозе, отражающий степень компенсации СД 1 типа, на 90 сутки посттрансплантационного периода показало изменение гликемической кривой подобно интактным животным только после интрапортальной и внутриселезеночной трансплантации ОПЖ неонатальных животных. В остальных группах животных при проведении теста толерантности к глюкозе начальный уровень глюкозы в крови был высокий, а гликемическая кривая растянута во времени, что отражало наличие нарушений в углеводном обмене животных – реципиентов.

HbA1c является показателем, который позволяет выявить степень компенсации углеводного обмена в отдаленные сроки после трансплантации ОПЖ (3-4 месяца). Уровень HbA1c исследовали на 91 сутки посттрансплантационного периода у всех экспериментальных групп. Следует отметить, что только у кроликов после внутриселезеночной АлТц и КсТц ОПЖ содержание HbA1c достоверно не отличалось от интактных животных, а у остальных групп этот показатель был повышен.

Изучение динамики инсулина в сыворотке крови показало увеличение данного показателя на 7 сутки после внутриселезеночной КсТц, при этом уровень инсулина у этой группы животных в 2,5 раза был выше значений интактных кроликов. В последующий период наблюдалось снижение инсулина у животных с ксенографтом в селезенки, однако на 98 сутки посттрансплантационного периода этот показатель в 1,2 раза превышал значения контроля. На 14 сутки после КсТц в портальную вену, в паренхиму печени, в костный мозг, в семенник и под капсулу почки уровень инсулина постепенно увеличивался у животных - реципиентов. Повторное снижение уровня инсулина в сыворотке крови у животных – реципиентов наблюдалось на 35 – 42 сутки после КсТц ОПЖ в печень, под капсулу почки, в семенник и в костный мозг, и на 98 сутки уровень инсулина у этих животных снижался до значений, характерных для животных с экспериментальным СД 1 типа. У кроликов с внутривенным ксенотрансплантатом ОПЖ не наблюдалось повышения уровня инсулина в сыворотке крови. После интрапортальной КсТц ОПЖ уровень инсулина до 49 суток в 1,5 раза превышал значения интактных животных, а в последующем периоде снижался до значений, установленных для интактных животных.

При гистологическом изучении срезов селезёнки были идентифицированы округлые структуры нетипичные для данного органа, состоящие из соединительнотканных волокон и единичных клеток, возможно, это фрагменты трансплантата, находящиеся в дегенеративном состоянии. Однако нормализация уровня инсулина и показателей углеводного обмена у кроликов после внутриселезёночной АлТц и КсТц ОПЖ дают нам возможность, предположить, что либо при окраске гематоксилином и эозином островки трудно было идентифицировать среди лимфоидной ткани органа, либо в обнаруженных структурах произошло накопление инсулина, который постепенно поступает в кровяное русло. В результате чего мы провели окрашивание срезов селезёнки в месте введения ОПЖ дитизон - содержащим раствором, который позволил нам идентифицировать хорошо сохранившиеся островки, расположенные в пульпе селезёнки.

В случае интрапортальной трансплантации ОПЖ неонатальных животных идентифицированы не были, так как на сегодня остается невыясненным механизм распределения ОПЖ в портальной вене.

Проведенный гистологический анализ показал, что независимо от места введения ОПЖ неонатальных животных через 3 месяца в ПЖ животных – реципиентов наблюдаются выраженные дегенеративно – дистрофические изменения, которые выражаются в сосудистых реакциях органа, в активации соединительной ткани, в микронекрозах ацинусов, в уменьшение числа островков в результате их лизиса.

Следовательно, АлТц и КсТц не приводят к восстановлению собственной ПЖ животных реципиентов, а нормализация показателей углеводного обмена, уровня инсулина у животных с интрапортальным и внутриселезёночным алло – и ксенографтами ОПЖ неонатального происхождения свидетельствует об эффективности данного способа компенсации СД 1 типа.

DiОC18 представляет собой полиметиновый краситель группы карбоцианины, который способен включаться в мембранный бислой клетки, сохраняясь в нем на протяжении 3-4 недель. В нашем исследовании мы впервые использовали краситель DiОC18 и подбор его концентрации для окрашивания β-клеток и ОПЖ неонатальных поросят, которые мы затем вводили в печень и в селезёнку, в органы, в которых наблюдался пролонгированный гипогликемический эфффект. На раннем посттрансплантационном сроке (3 недели) с помощью проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии мы идентифицировали объекты, имеющие зелёную флуоресценцию в области 510 нм, выделенные из суспензии полученной из фрагмента печени и селезёнки.

Таким образом, АлТц и КсТц ОПЖ неонатальных животных в селезенку и в портальную вену являются более эффективными сайтами, чем паренхима печени, семенник, капсула почки, костный мозг и внутривенная, так как позволяют в течении длительного времени поддерживать гликемию в пределах нормальных значений, адекватно регулировать углеводный обмен и поддерживать уровень инсулина в сыворотке крови на достаточно высоком уровне. Кроме того, в селезёнке наблюдалась сохранность островков на позднем посттрансплантационном сроке (98 сутки). Трансплантация ОПЖ в костный мозг, паренхиму печени, семенник и под капсулу почки имеет кратковременный антидиабетический эффект, а внутривенная трансплантация не вызывает гипогликемического эффекта в организме животных – реципиентов

Несмотря на полученные позитивные результаты влияния трансплантации ОПЖ в селезёнку и в портальную вену печени на компенсацию СД 1 типа, оставался открытым вопрос, касающийся того, вызывает ли интрапортальное и внутриселезёночное введение ОПЖ нарушение функции данных органов.

Поэтому, в нашей работе мы провели исследование биохимических параметров и показателей крови, отражающих функциональное состояние печени и селезёнки.

Для изучения функции печени после интрапортальной КсТц были исследованы такие показатели, как содержание общего и прямого билирубина, содержание креатинина и альбумина, активности АлАт, АсАт, ЩФ в сыворотке крови экспериментальных животных. До интрапортальной КсТц ОПЖ общий и прямой билирубин, креатинин, активности АсАт, АлАт, ЩФ в крови превышали значения интактных животных, а уровень альбумина был ниже. На 3 сутки после КсТц ОПЖ в портальную вену наблюдалось постепенное снижение уровня общего и прямого билирубина, уровня креатинина, активности АсАт, АлАт, ЩФ и соотношения АсАт/АлАт, и увеличение содержания альбумина в сыворотке крови. С 7 суток посттрансплантационного периода все показатели находились в пределах нормальных значений. Однако на 77 сутки в сыворотке крови животных с интрапортальным ксенографтом наблюдалось повторное повышение уровня общего билирубин, прямого билирубина, креатинина, активности АсАт, АлАт, ЩФ, оставаясь на таком уровне весь последующий период наблюдения. Содержание альбумина и соотношение АсАт/АлАт на протяжении 91 суток оставалисьь в пределах контрольных значений.

Следовательно, интрапортальное введение ОПЖ не вызывало тяжелых посттрансплантационных осложнений, что подтверждали биохимические показатели крови, отражающие функциональное состояние печени, которые на 7 сутки достигали уровня, характерного для интактных животных. Повышение исследуемых биохимических показателей на 77 сутки посттрансплантационного периода связано с повторным повышение глюкозы в крови животных с интрапортальным ксенографтом ОПЖ до 11-12 ммоль/л, так как у животных с экспериментальным СД 1 типа все исследуемые биохимические показатели были повышены на протяжении всего периода.

Показателями наличия внутриселезёночной патологии являются показатели крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов, патологические формы эритроцитов, СОЭ), содержание билирубина и гемоглобина в крови, масса селезёнки. Внутриселезёночная КсТц ОПЖ имела длительный гипогликемический эффект и позволяла нормализовать в организме такие показатели, как уровень билирубина и СОЭ, которые были увеличены до проведения КсТц ОПЖ, что было связано с развитие СД 1 типа. Внутриселезеночная КсТц ОПЖ не вызывала нарушений функции селезёнки, что подтверждало отсутствие патологических форм эритроцитов, гиперспленизма и неизменность количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов, а также времени свертывания крови. Повышение на 3 сутки посттрансплантационного периода количества клеток крови, СОЭ и снижение времени свертывания крови было связано с оперативным вмешательством. Уровень гемоглобина у кроликов после внутриселезеночной КсТц ОПЖ находился в пределах нормальных значений на протяжении всего периода наблюдения. У кроликов с экспериментальным диабетом на 3 сутки после тотальной спленэктомии количество клеток крови, СОЭ, уровень билирубина были увеличены, а содержание гемоглобина, время свертывания крови были ниже значений, установленных для интактных животных. При исследовании мазков крови сидероциты были обнаружены на 35-49 сутки только у спленэктомированных кроликов. К 91 суткам у спленэктомированных животных количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов, СОЭ снижались, а время свертывания крови повышалось, однако значений, характерных для интактных животных эти показатели не достигали.

Таким образом, отсутствие значительных отклонений в биохимических параметрах и показателях крови после интрапортальной и внутриселезеночной ксенотрансплантаций ОПЖ свидетельствуют о том, что данные ксенографты не вызывают тяжелых осложнений, приводящих к функциональным нарушениям в печени и в селезёнке.

Подводя итоги вышесказанному, можно заключить, что привилегированными сайтами для трансплантации ОПЖ неонатальных животных являются селезёнка и портальная вена, при этом происходит нормализация показателей углеводного обмена и сохраняется гормональная активность на протяжении длительного периода времени, сопровождающаяся адекватной компенсацией СД 1 типа в организме животных - реципиентов. Внутриселезеночная и интрапортальная КсТц ОПЖ не вызывают развитие тяжелых посттрансплантационных осложнений, кроме того внутриселезёночная КсТц ОПЖ способствует сохранению островков в месте трансплантации.

ВЫВОДЫ

1. Динамика уровня инсулина в процессе культивирования островков поджелудочной железы и способность адекватно отвечать на изменение концентрации глюкозы является сходным для обоих видов неонатальных животных, однако абсолютные значения секреции инсулина были выше в культуре островков поджелудочной железы неонатальных кроликов. Длительное культивирование островков поджелудочной железы обоих видов животных приводит к уменьшению секреции инсулина.

2. Способ введения островков поджелудочной железы оказывает существенное влияние на компенсацию углеводного обмена при экспериментальном сахарном диабете 1 типа. Наилучший эффект в компенсации углеводного обмена, восстановлении инсулинпродуцирующей способности и длительности функционирования достигается при трансплантации островков поджелудочной железы неонатальных животных в селезёнку и в портальную вену печени. Трансплантация островков поджелудочной железы в костный мозг, в паренхиму печени, в семенник и под капсулу почки имеет кратковременный эффект в нормализации показателей углеводного обмена.

3. С помощью полиметинового красителя DiОC18 и метода проточной цитофлуориметрии установлено, что островки поджелудочной железы неонатальных поросят на 3 неделю сохраняются в сайте трансплантации, чем и обусловлено снижение уровня глюкозы у животных с экспериментальным СД 1 типа.

4. Гистохимический анализ сайтов, в которые осуществляли трансплантацию островков поджелудочных желез неонатальных поросят, показал долгосрочное выживание ксенотрансплантата в селезенке, где были идентифицированы сохранившиеся дитизон – позитивные островки.

5. На основе измерения биохимических показателей, отражающих функции печени, было установлено, что ксенотрансплантация островков поджелудочной железы не вызывает развитие у животных - реципиентов посттрансплантационных осложнений, приводящих к нарушению функции печени.

6. Показатели крови и биохимические параметры, отражающие функциональное состояние селезёнки, у животных с внутриселезеночным ксенографтом островков поджелудочной железы показали отсутствие посттрансплантационных осложнений, которые приводят к нарушению функции селезёнки.

7. Гистологический анализ собственных поджелудочных желез животных – реципиентов показал отсутствие её восстановления независимо от места введения островков поджелудочной железы неонатальных животных, являясь доказательством того, что снижение уровня гликемии повышение содержания инсулина в крови животных – реципиентов, связано с функционирование трансплантата.