- •Колот Наталья Владимировна
- •Компенсация углеводного обмена у кроликов с экспериментальным сахарным диабетом 1 типа при трансплантации островков поджелудочной железы в разные сайты организма
- •Содержание
- •Введение
- •Раздел I
- •1.1. Современные представления о физиологии поджелудочной железы и её роли в жизнедеятельности организма.
- •1.1.1. Эмбриональное становление поджелудочной железы.
- •1.1.2. Инсулин, регуляция его синтеза и секреции.
- •1.1.3. Физиологические эффекты инсулина в организме.
- •1.2. Cахарный диабет 1 типа.
- •1.3. Трансплантация островков поджелудочной железы как метод лечения сахарного диабета 1 типа.
- •1.4. Выживание островков поджелудочной железы в различных сайтах организма.
- •Раздел II
- •2.1. Получение островков поджелудочной железы.
- •2.2. Разделение суспензии клеток и островков поджелудочной железы в градиенте плотности фиколла.
- •2.3. Культивирование островков поджелудочной железы.
- •2.4. Выявление β-клеток островков поджелудочной железы с помощью специфической реакции на дитизон.
- •2.5. Определение базального и стимулированного уровня инсулина в среде культивирования.
- •2.6. Измерение активности α - амилазы в среде культивирования островков поджелудочной железы.
- •2.7. Экспериментальная модель сахарного диабета.
- •2.8. Трансплантация островков поджелудочной железы животным с экспериментальным сд 1 типа.
- •Экспериментальные группы животных:
- •2.9.1. Определение содержания глюкозы в цельной крови.
- •2.11. Определение уровня инсулина в сыворотке крови.
- •2.12. Определение уровня с-пептида в сыворотке крови.
- •2.13. Измерение биохимических показателей в сыворотке крови экспериментальных животных.
- •2.14. Определение показателей крови у экспериментальных животных.
- •2.15. Гистологический анализ образцов.
- •2.16. Реактивы.
- •2.17. Статистическая обработка результатов.
- •3.1. Изучение структурно - функциональных свойств островков поджелудочной железы неонатальных поросят и кроликов in vitro
- •3.3. Использование флуоресцентного красителя DiОc18 для идентификации трансплантата островков поджелудочной железы.
- •3.4. Изучение влияния ксенотрансплантации островков поджелудочной железы интрапортально и внутриселезеночно на функцию печени и селезенки
- •3.4.1. Влияние интрапортальной ксенотрансплантации островков поджелудочной железы на функциональное состояние печени
- •3.4.2. Влияние внутриселезеночной ксенотрансплантации островков поджелудочной железы на функциональное состояние селезенки
- •Заключение
- •Список использованной литературы
Введение
Актуальность темы. В настоящее время наблюдается неуклонный рост распространенности сахарного диабета (СД). Увеличение заболеваемости, тяжелые и быстроразвивающиеся осложнения привели к тому, что СД относят к триаде самых распространенных заболеваний [24, 47]. Следует отметить, что СД в 2-3 раза увеличивает смертность и на 10-30% укорачивает продолжительность жизни людей [10, 335]. Известно, что наиболее тяжелой формой диабета является СД 1 типа. Этот тип заболевания относят к важнейшим медико-социальным проблемам здравоохранения [25, 157], так как он возникает вследствие аутоиммунной деструкции инсулинпродуцирующих β-клеток островков Лангерганса в основном в детском, юношеском возрасте, среди трудоспособного населения и характеризуется тяжестью течения, ранней инвалидизацией и гибелью, обусловленной многокомпонентными нарушениями метаболизма и развитием тяжелых диабетических осложнений [49, 275].
Важным фактором в предотвращении развития микрососудистых осложнений СД 1 типа является компенсация углеводного обмена путём инсулинотерапии. Однако инсулинотерапия имеет ряд недостатков, к которым относят постоянное введение инсулина и контроль за гликемией, субъективную непереносимость препарата, появление отёков и гиперстезии в местах введения инъекции [200, 208]. Кроме того, комбинированная инсулинотерапия особенно при лабильном течение СД 1 типа может вызывать гипогликемические состояния, сопровождающиеся комой и кетоацидозом, а также приводит к парадоксальному эффекту – ускоряет развитию микрососудистых осложнений [10, 55].
В связи с этим необходимым стал поиск эффективного способа лечения СД 1 типа. Трансплантация островков поджелудочной железы (ОПЖ) или β-клеток является альтернативным и более физиологическим способом коррекции гипергликемии при СД 1 типа по сравнению с традиционной терапией, так как позволяет создать в организме реципиента функциональное „депо” эндогенных гормонов [53, 102, 212, 232]. При использовании метода трансплантации в лечении СД 1 типа важно обеспечить не только максимальную гормонопродукцию трансплантата, но и его эффективную эндокринную регуляцию, что возможно при сохранении нативной архитектуры островков [190, 309].
В настоящее время в клинической практике стал широко использоваться Эдмонтонский протокол, согласно которому аллотрансплантация (АлТц) ОПЖ, полученных от двух и более доноров, при использовании комбинированной иммуносупрессивной терапии, способствует восстановлению нормогликемии и регуляции углеводного обмена, а также отодвигает или предупреждает развитие диабетических осложнений [293]. Использование Эдмонтонского протокола в клинике требует решения целого ряда вопросов, к которым относят ограниченный запас аллогенного донорского материала [97, 308], а также токсичность некоторых иммуносупрессантов по отношению к ОПЖ [162, 286].
Имеющиеся экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что ксенотрансплантация (КсТц) ОПЖ или β-клеток, полученных от неонатальных поросят [68, 102, 273, 316] и кроликов [84, 110], по своему эффекту не уступает АлТц. Использование ОПЖ свиней в качестве трансплантационного материала позволяет избежать этических, моральных и правовых проблем [109], а создание первых нокаутных свиней, лишенных гена, кодирующего синтез фермента галактозил-трансферазы, который является ответственным за продукцию Gal-олигосахаридов [218, 266], открывает новые возможности проведения успешной КсТц и преодоления барьера гистосовместимости.
Прогресс в области культивирования позволяет увеличить количество трансплантационного материала и снизить его иммуногенность [44]; современный уровень криоконсервирования позволяет неограниченный период времени сохранять жизнеспособность и функциональную активность ксенотрансплантата [13, 26, 129]. Однако на сегодняшний день ещё существует множество нерешённых вопросов, которые связаны с механизмами развития острого и хронического отторжения трансплантатов в организме реципиента.
Одной из задач современной трансплантологии является поиск эффективных способов продления сроков функционирования трансплантата. Известно, что трансплантация ОПЖ в иммунопривелегированные сайты организма реципиента является одним из способов защиты трансплантата от иммунной агрессии [207]. Например, аутографты ОПЖ, введенные в пульпу селезёнки, могут функционировать в организме животных с экспериментальным диабетом на протяжении 1 года - 3 лет [237, 311]. Аллогенные островки лучше выживают под капсулой почки [120, 241], в семеннике [256], в костном мозге [283]. АлТц ОПЖ в портальную вену при испльзовании комбинированной иммуносупрессивной терапии позволяет длительное время поддерживать нормогликемию и стабилизировать течение СД [117, 293]. Однако интрапортальная трансплантация островков взрослых свиней способствует активации иммунных процессов в организме реципиента и быстрой потере ксенографта [313].
Несмотря на то, что исследования по трансплантации ОПЖ ведутся уже на протяжении значительного времени, в литературе отсутствуют данные о КсТц ОПЖ неонатальных поросят в портальную вену, паренхиму печени, селезёнку, семенник, костный мозг и внутривенно. КсТц предварительно культивированных ОПЖ неонатальных поросят под капсулу почки мышей способствует поддержанию нормогликемии в организме реципиентов на протяжении 20 недель [308]. Встречаются данные и об успешных комбинированных КсТц ОПЖ неонатальных поросят с клетками Сертоли под капсулу почки, в печень через портальную вену [195], под кожу [310], при которых антидиабетический эффект у животных - реципиентов сохраняется от 3 месяцев до 4 лет.
Однако на сегодня в мировой литературе отсутствуют данные, касающиеся эффекта трансплантации ОПЖ неонатальных кроликов в портальную вену, паренхиму печени, семенник, костный мозг, под капсулу почки, внутривенно при экспериментальном СД 1 типа. До сих пор остаётся неизученным вопрос о том, какой сайт в организме реципиента является иммунопривилегированным для ксеногенных ОПЖ неонатальных животных (поросят и кроликов), а также данные о влияние ОПЖ неонатальных животных на углеводный обмен при СД 1 типа.
Таким образом, вопрос о подборе наиболее приемлемого сайта в организме для АлТц и КсТц ОПЖ неонатальных животных, учитывая его влияние на параметры выживаемости и функциональной активности трансплантата, а также изучение морфо - функциональных особенностей ОПЖ, полученных от неонатальных доноров in vitro, требует детального анализа и проведения собственных экспериментальных исследований. Кроме того, детальное изучение пре- и пострансплантационных изменений (показатели углеводного обмена, динамика инсулина, изменение массы тела) является актуальным для изучения возможности лечения СД 1 типа путём КсТц неонатальных ОПЖ.
Связь работы с научными программами, планами, темами.
Диссертационная работа выполнялась в рамках госбюджетной темы Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина «Механізми впливу фізичних факторів і біологічно активних речовин на ДНК, білки та біомембрани» (№ государственной регистрации – 019U016741) и научной тематики Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины «Дослідження механізмів функціонування кріоконсервованих органних культур ендокринних тканин» (№ государственной регистрации – 0101U003478).
Цель и задачи исследования.
Цель работы - проведение сравнительного анализа морфо - функциональных характеристик островков поджелудочной железы неонатальных животных (поросят и кроликов) in vitro и при алло - и ксенотрансплантации в зависимости от выбора сайта трансплантации в организме – реципиента на компенсацию углеводного обмена при экспериментальном сахарном диабете 1 типа.
Для достижения данной цели предполагалось решить ряд задач:
1. Оценить влияние условий получения ОПЖ неонатальных животных на их способность к росту и пролиферации в культуре.
2. На основе морфометрического и гистохимического анализа ОПЖ неонатальных животных in vitro изучить инсулинпродуцирующую способность.
3. Исследовать показатели углеводного обмена и гормональный уровень у кроликов с экспериментальным СД 1 типа в зависимости от выбора сайта трансплантации организма при АлТц и КсТц ОПЖ.
4. При использовании в качестве трейсера флуоресцентный краситель DiОC18 проследить сохранность трансплантата ОПЖ.
5. Оценить влияние трансплантации ОПЖ неонатального происхождения на физиологические и биохимические показатели функции органа, в который осуществляли трансплантацию и был достигнут наилучший эффект компенсации экспериментального СД 1 типа.
6. Провести гистологический и гистохимический анализ трансплантационного материала, а также собственных ПЖ животных – реципиентов после трансплантации ОПЖ неонатальных поросят и кроликов.
Объект исследования.
Процессы восстановления гормонального статуса и углеводного обмена у животных с экспериментальным диабетом до и после АлТц и КсТц ОПЖ неонатальных животных в различные сайты организма. Биохимические параметры и показатели крови у кроликов с интрапортальным и внутриселезёночным ксенотрансплантатом ОПЖ.
Предмет исследования.
ОПЖ неонатальных поросят и кроликов с различной функциональной активностью in vitro и после трансплантации в различные сайты организма животных с экспериментальным СД 1 типа.
Методы исследования.
В работе использовались методы ферментативного получения ОПЖ неонатальных животных, разделения ОПЖ в ступенчатом градиенте плотности фиколла, культивирования ОПЖ, гистохимический метод идентификации β-клеток с помощью специфической реакции на дитизон, метод трансплантации в различные сайты организма, иммуноферментный и радиоиммунологический методы определения содержания инсулина и С-пептида, глюкозооксидазный метод определения глюкозы в крови, при использовании индикаторных пластинок Гемоглан и глюкометра Глюкофот-II, цитофлуориметрический метод определения островков и клеток, окрашенных полиметиновым красителем DiOС18, метод световой микроскопии, метод специфического окрашивания мазков крови на ретикулоциты и сидероциты, метод определения скорости оседания эритроцитов и времени свертывания крови, гистологический анализ, спектрофотометрический метод определения биохимических показателей крови, математический анализ результатов.
Научная новизна полученных результатов.
В диссертационной работе представлен сравнительный анализ морфо - функционального состояния ОПЖ неонатальных доноров отдаленного филогенетического родства (поросят и кроликов) in vitro. Усовершенствован метод выделения ОПЖ неонатальных животных в ступенчатом градиенте плотности фиколла.
Проведен сравнительный анализ влияния сайта трансплантации организма ОПЖ неонатального происхождения на гормональный статус и углеводный метаболизм животных с экспериментальным CД 1 типа на длительных сроках наблюдения после трансплантации.
Использование полиметинового красителя DiОС18 при трансплантации ОПЖ позволило идентифицировать трансплантат спустя 3 недели посттрансплантационного периода. Методом цитофлуориметрических исследований при помощи флуоресцентного красителя DiОС18 было показано, что снижение уровня глюкозы и нормализация углеводного обмена на ранних сроках после КсТц (3 недели) коррелирует с функциональными свойствами трансплантата ОПЖ неонатальных поросят.
Иммунопривилегированными сайтами, в который осуществляли АлТц и КсТц ОПЖ, оказались селезёнка и портальная вена. Трансплантация в эти сайты сопровождалась длительной нормогликемии и нормализацией углеводного обмена, а также поддержанием уровня инсулина в организме животных - реципиентов на протяжении длительного периода времени без использования иммуносупрессантов. КсТц ОПЖ в селезёнку и в портальную вену не приводила к развитию функциональных нарушений в данных органах, что подтвердили биохимические параметры и показатели крови. Полученные нами данные свидетельствуют о возможности использования ксеногенных ОПЖ в качестве трансплантационного материала для компенсации СД 1 типа на организменном уровне. АлТц и КсТц ОПЖ неонатального происхождения в костный мозг, в паренхиму печени, в семенник и под капсулу почки имели кратковременный гипогликемический эффект в организме реципиентов, а внутривенная АлТц и КсТц ОПЖ не являлась эффективной, поскольку не позволяла нормализовать гликемию и другие показатели углеводного обмена в организме животных с экспериментальным СД 1 типа.
Гистохимический анализ с помощью специфической окраски на инсулин позволили установить присутствие трансплантированных ОПЖ в селезёнке на поздних сроках трансплантации (3 месяца).
Впервые была детально изучена динамика биохимических и физиологических показателей, характеризующих функциональное состояние селезёнки и печени как сайтов организма, в которые была осуществлена трансплантация ОПЖ. При этом было установлено, что ксенотрансплантация ОПЖ в портальную вену печени и селезёнку не вызывает посттрансплантационных осложнений и функциональных нарушений в этих органах у животных - реципиентов.
Практическая значимость полученных результатов.
Установлено, что ОПЖ неонатальных животных сохраняют свои морфо - функциональные характеристики при культивировании в течение 6-ти суток. Показано, что условия получения ОПЖ отличаются между двумя видами неонатальных доноров. ОПЖ неонатальных поросят при разделении в ступенчатом градиенте плотности фиколла и проведении специфической реакции с дитизоном концентрируются в слое фиколла с плотностью 1,089 г/см3, а ОПЖ неонатальных кроликов обнаруживаются в слое фиколла с плотностью 1,080 г/см3.
Получены новые данные, касающиеся влияния сайта трансплантации организма при АлТц и КсТц ОПЖ неонатальных животных на компенсацию экспериментального СД 1 типа, которые имеют практическое значение для развития тканевой и клеточной трансплантологии, а также экспериментальной эндокринологии и хирургии.
Впервые проведен подбор концентраций полиметинового флуоресцентного красителя DiОС18 для окрашивания ОПЖ неонатальных поросят, который затем использовали для идентификации ксенографта на 3 недели после трансплантации в печень и в селезёнку.
Всесторонний анализ результатов трансплантации ОПЖ неонатальных животных открывает перспективу для возможного использования этого способа в клинике для лечения СД 1 типа, особенно с лабильным течением, в качестве альтернативы заместительной инсулинотерапии. А также разработать стратегию наиболее эффективного использования ОПЖ в условиях трансплантации, на основе увеличения сроков функционирования трансплантата в организме реципиента.
Получен декларационный патент Украины «Спосіб корекції гіперглікемії при інсулінозалежному цукровому діабеті» №32227. Согласно данному декларационному патенту интрапортальная трансплантация ОПЖ неонатальных поросят позволяет поддерживать в течение длительного времени нормогликемию и снизить риск развития вторичных диабетических осложнений у кроликов с экспериментальным СД 1 типа. Дополнительное введение клеток Сертоли в портальную вену печени в месте с основным ксенотрансплантатом ОПЖ позволяет продлить антидиабетический эффект.
Результаты исследований используются для преподавания дисциплины „Эндокринология” и „Физиология человека и животных” Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина, и могут быть использованы при преподавании курсов нормальной и патологической физиологии и эндокринологии на биологических факультетах университетов и высших медицинских учебных учреждениях, а также в работе научно - исследовательских организаций эндокринологического профиля.
Личный вклад соискателя.
Вынесенные на защиту положения и экспериментальные данные, получены при непосредственном участии диссертанта, которое заключается в самостоятельном планировании исследований, проведении серии экспериментов in vitro и in vivo, изучении биохимических и физиологических параметров, проведении гистохимических и гистологических исследований, интерпретации и математическом анализе полученных результатов, формулировании выводов.
Автор высказывает благодарность сотрудникам отдела криобиохимии и фармакологии нейрогуморальных систем Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины.
Апробация результатов диссертации.
Основные положения и результаты работы изложены и обсуждены на заседаниях отдела криобиохимии и фармакологии нейрогуморальных систем Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины и на заседаниях ученого совета биологического факультета Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина; материалы диссертации представлены на научно - практических конференциях: І конференция молодых ученых с международным участием «Біологія: від молекули до біосфери» (Харьков, 2006), научно – практической конференции «Профілактика, діагностика та лікування – основні складові терапії» (Харьков, 2006), ІІІ и ІV научных конференциях студентов и аспирантов с международным участием «Молодь та поступ біології» (Львов, 2007, 2008), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007); IV, V съезде транспланталогов Украины с международным участием (Киев, 2007, 2008), VII Данилевських чтениях (Харьков, 2008), V медико - фармацевтической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Черновцы, 2008), конференции молодых ученых: «Холод у біології та медицині» (Харьков, 2008); IV Всероссийском съезде трансплантологов, посвященном памяти В.И. Шумакова (Москва, 2008).
Публикации.
По результатам диссертации опубликовано _ научных работ, в том числе _ статей, _ из которых - в специализированных научных журналах, 9 тезисов докладов, получен 1 декларационный патент Украины «Спосіб корекції гіперглікемії при інсулінозалежному цукровому діабеті» №32227.
Структура диссертации.
Материалы диссертационной работы изложены на__страницах печатного текста, в том числе на __страницах цитируемая литература. Диссертация состоит из введения, основной части, которая состоит из трех разделов (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение), выводов, списка использованной литературы, которая насчитывает _ источников, из них __ отечественных и __ иностранных. Диссертационная работа проиллюстрирована _ рисунками и _ микрофотографиями, содержит _ таблиц.