2.4. Выявление β-клеток островков поджелудочной железы с помощью специфической реакции на дитизон.

Идентификацию β-клеток в суспензии клеток и ОПЖ проводили, используя раствор дитизона (100 мкг/мл). Раствор дитизона готовили путем разведения 50 мг кристаллического субстрата дитизона в 5 мл диметилсульфоксида [301]. К 1 мл суспензии клеток и ОПЖ добавляли 10 мкл раствора дитизона и инкубировали в течение 15 минут при 37°С после чего отмывали от красителя один раз средой 199.

В конце срока наблюдения животных забивали, ПЖ и селезёнку с трансплантатом ОПЖ помещали в 10% раствор нейтрального формалина. Специфическое гистохимическое окрашивание парафиновых срезов ПЖ и селезёнки с трансплантатом для выявления ОПЖ проводили по методу Магера, используя дитизоновый раствор [72].

Исследования проводили под световым микроскопом при увеличении х 20, х 40. Микрофотосъёмку осуществляли на микроскопе Olympus XI71.

2.5. Определение базального и стимулированного уровня инсулина в среде культивирования.

Уровень инсулина в среде культивирования определяли каждый день на протяжении всего периода культивирования ОПЖ неонатальных животных иммуноферментным методом с помощью стандартного набора INSULIN ELISA KIT (DRG Diagnostic, США).

Помимо базальной секреции инсулина осуществляли измерение и глюкозо - стимулированной секреции инсулина. Для этого отбирали полностью среду культивирования и добавляли 1 мл 1,67 мМ раствора глюкозы, инкубировали в течение 1 часа при 37°С, затем собирали полученную среду, а к культуре ОПЖ добавляли 1 мл 10 мМ раствора глюкозы, инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С. Раствор глюкозы был приготовлен на основе среды 199 с антибиотиками.

2.6. Измерение активности α - амилазы в среде культивирования островков поджелудочной железы.

Определение активности α - амилазы в культуральной среде ОПЖ проводили на протяжении 8-ми суток культивирования, используя стандартный набор (Felicit - Диагностика, Украина) и фотометрический прибор (КФК 2 - УХЛ 42).

2.7. Экспериментальная модель сахарного диабета.

СД 1 типа вызывали у самцов кроликов породы шиншилла, которых содержали в стандартных условиях вивария ИПКиК НАН Украины при нормальном освещении и при свободном доступе к пище и воде, на рациональном питании, соответствующем нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в условиях эксперимента» [42].

СД 1 типа у экспериментальных животных был вызван однократным внутривенным введением раствора аллоксана тетрагидрата из расчета 100 мг/кг массы тела животного. Раствор аллоксана готовили непосредственно перед введением путем разведения субстрата кристаллического аллоксана тетрагидрата в 2 мл стерильного физиологического раствора.

2.8. Трансплантация островков поджелудочной железы животным с экспериментальным сд 1 типа.

Для трансплантации были отобраны животные с экспериментальным СД 1 типа, у которых уровень глюкозы в крови был не ниже 19-20 ммоль/л. Трансплантацию ОПЖ неонатальных животных (кроликов и поросят) проводили в стерильных условиях под комбинированной кетамин - ксилазиновой анестезией (1 мг кетамина и 0,5 мг ксилазина на 1 кг массы тела животного). Доза трансплантационного материала соответствовала количеству ОПЖ, полученных из 3 ПЖ неонатальных поросят и 4-5 ПЖ неонатальных кроликов на одного реципиента и составляла в среднем 1-2× 10⁶/мл. К суспензии полученных клеток добавляли среду 199 с антибиотиком и трансплантировали в печень – 3 мл, в портальную вену – 3 мл, селезенку – 2 мл, под капсулу почки – 3 мл, в левый семенник – 3 мл, в костный мозг – 2 мл. Введение трансплантата внутривенно (2 мл) осуществляли, используя те же условия наркоза. Иммуносупрессивная терапия не использовалась после трансплантации ни в одном из случаев. Животных наблюдали в течение 3 - 4 месяцев с момента трансплантации. В качестве контроля были изучены группы животных ложнооперированные контрольные и с экспериментальным СД 1 типа, которым вводили среду 199 с антибиотиками в каждое из вышеуказанных мест, при этом объем среды соответствовал объему трансплантационного материала.