Мікробіологія кормів

Робота 40. Кількісний облік мікроорганізмів на зерні

Обладнання, реактиви та унаочнення. Проби зерна, колбу з 50 мл стерильної водопровідної води, стерильний пісок, стерильні піпетки Мора на 10 мл, колби, що містять по 90 мл стерильної водопровідної води, піпетки на 1 мл, стерильні чашки Петрі, розплавлений і охолоджений до 50°С МПА, термостат з температурою 30°С, елективні середовища.

Проведення роботи. Наважку масою 5 г поміщають в колбу з 50 мл стерильної водопровідної води і 2-3 г піску. Колбу збовтують круговими обертальними рухами 10 хв. З одержаної витяжки готують розведення (10^-2; 10^-3; 10^-4). Окремими стерильними піпетками Мора беруть по 10 мл суспензії і переносять в колби, що містять по 90 мл стерильної водопровідної води. Потім з кожної колби беруть по 1 мл суспензії відповідного розведення в стерильні чашки Петрі в двох повторностях. В кожну чашку Петрі виливають по 1 пробірці розплавленого, але попередньо охолодженого до 50°С МПА. Чашки інкубують при 30°С. Поряд з МПА використовують елективні середовища.

Через 3-5 днів інкубації підраховують загальне число колоній, що виросли на МПА в чашках, і розраховують кількість мікроорганізмів на 1 г зерна.

Результати досліду______________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Висновки______________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Робота 41. Кількісний облік мікроорганізмів в силосі

Теоретична основа. Молочнокислі бактерії, які співіснують на рослинах, відіграють велику роль при силосуванні кормів. В основі силосування лежить молочнокисле бродіння. Молочнокислі бактерії зброджують цукри рослин, що силосуються, в молочну і частково оцтову кислоти, які пригнічують розвиток гнильних, маслянокислих і інших бактерій, що знижують якість корму. Молочнокислі бактерії знижують рН корму до 4,2-4,0. Якщо кислотність силосу з тих або інших причин зменшується (рН вище 4,5-4,7), то створюються умови, що сприяють життєдіяльності мікроорганізмів, які погіршують зберігання корму. В ньому нагромаджуються масляна кислота, аміни, аміак і інші продукти.

Для того, щоб забезпечити нормальний розвиток молочнокислих бактерій в процесі силосування, необхідний достатній вміст цукру в рослинах, що силосуються, і створення анаеробних умов. Цвілеві гриби витримують сильне підкислення, але будучи строгими аеробами, не можуть розмножуватися в добре спресованому і укритому, заквашеному кормі.

Хороший силос характеризується наступними показниками: колір – оливково-зелений (лише дещо змінюється), запах – приємний (мочених яблук, печеного хліба), рН – 4-4,2, загальна кислотність – 2- 2,6% (в перекладі на молочну кислоту), вологість – 70%. Мікрофлора хорошого силосу представлена молочнокислими паличками і молочнокислими стрептококами, часто в невеликих кількостях зустрічаються дріжджі. Останні утворюють ефіри, що додають силосу приємного запаху і збагачують корм білком і вітамінами. Проте у великих кількостях дріжджі погіршують якість силосу – знижують його кислотність, оскільки є конкурентами молочнокислих бактерій в споживанні цукру.

В перший період після закладки силосу бурхливо розвивається мікрофлора змішаної фази бродіння, яка представлена на поверхні здорових рослин: гнильні бактерії (в основному палички, які не утворюють спор), бактерії групи кишкової палички, маслянокислі бактерії і ін. При зростанні кислотності корму їх змінюватимуть молочнокислі стрептококи, а потім більш кислототривкі молочнокислі палички. За два тижні (при зниженні рН до 4,0 і нижче) мікробіологічні процеси в силосі в основному закінчуються.

Для аналізу з торцевої частини траншеї, ям або наземних буртів беруть середню пробу силосу. Знявши стерильним ножем верхній шар, вирізують кубики по середній лінії бурту з інтервалом в 1 м. Їх складають в стерильну скляну банку на 1-2 л з притертою пробкою так, щоб силос був укладений щільно і доверху. Проби перемішують в стерильному кристалізаторі, подрібнюють стерильними ножицями і беруть наважки для аналізів.

Обладнання, реактиви та унаочнення. Проба силосу, колба з 50 мл стерильної водопровідної води і 2-3 г піску, стерильні піпетки Мора на 10 мл, колби, що містять по 90 мл стерильної водопровідної води, піпетки на 1 мл, стерильні чашки Петрі, розплавлений і охолоджений до 50°С МПА, піпетки на 1 мл, сусло-агарі з крейдою або капустяному агарі з крейдою, а також на капустяному агарі із спиртом і крейдою, сусло-агар із стрептоміцином, середовищі Ємцеві, картопляне середовище, МПБ з поплавками, середовище Гільтая, МПА і сусло-агар 1:1, середовище Кеслер або Буліра, розчину Люголя.

Проведення роботи. Наважку силосу (5 г) вносять в колбу з 50 мл стерильної водопровідної води і 2-3 г піску. Колбу збовтують круговими обертальними рухами 10 хв. З одержаної витяжки готують розведення (10²; 10³; 10⁴; 10⁵; 10⁶), а потім висівають відповідні розведення на елективні середовища: 1 мл суспензії – при глибинному посіві, 0,05 мл суспензії – при поверхневому. Інкубація при 28°С.

Визначення кількості молочнокислих бактерій проводять на сусло-агарі з крейдою або капустяному агарі з крейдою, а також на капустяному агарі із спиртом і крейдою – глибинний посів. Навкруги колоній молочнокислих бактерій унаслідок накопичення молочної кислоти утворюються зони розчинення крейди.

Колонії молочнокислих бактерій на сусло-агарі з крейдою і капустяному агарі з крейдою підраховують на 5-6-й день, а на капустяному агарі із спиртом і крейдою – на 7-10-й день. Останнє середовище необхідне для виявлення молочнокислих бактерій у складі епіфітної мікрофлори, оскільки спирт гальмує ріст сторонньої мікрофлори. Кількість сторонньої мікрофлори (аеробних гнильних мікроорганізмів) визначають глибинним посівом на пептонному агарі. Підрахунок колоній ведуть на 5-7-й день.

Кількість мікроскопічних грибів і дріжджів визначається на сусло-агарі із стрептоміцином поверхневим посівом. Підрахунок колоній ведуть на 3-4-й день, при необхідності повторно – на 7-8-й.

Титр маслянокислих бактерій встановлюють на рідкому середовищі Ємцева і картопляному середовищі. Для визначення кількості спор маслянокислих бактерій роблять посів з суспензії після її пастеризації протягом 10 хв. при 75°С. Облік ведуть за інтенсивністю виділення газу (шматочки картоплі спливають), титр маслянокислих бактерій і їх спори встановлюють методом граничних розведень за Мак-Креді.

Протеолітичні аеробні бактерії визначають на МПБ за накопиченням газу в поплавках. Посіви витримують при 28°С два тижні.

При аналізі силосів з трав, вирощених на фоні високих доз азотних добрив, денітрифікуючі бактерії визначають на середовищі Гільтая. Посіви витримують 10-12 днів при 28°С. Кількість денітрифікаторів визначають за інтенсивністю виділення газу і зміні кольору індикатора.

При аналізі силосу враховують також спори гнильних бацил аеробів. На щільному середовищі (МПА і сусло-агар 1:1) роблять поверхневий посів. Чашки інкубують при 28°С, підрахунок колоній проводять на 4-й день.

Бактерії групи кишкової палички враховують на середовищі Кеслер або Буліра за виділенням газу і накопиченням його в поплавках. Пробірки витримують 48 год. при 40-42°С.

Домінуючі на щільних середовищах колонії проглядають під мікроскопом. Для виявлення маслянокислих бактерій з пробірок з картоплею готують препарат в придушеній краплі з додаванням розчину Люголя.

Склад елективних середовищ.

Сусло-агар з крейдою. Сусло, розбавлене до 3 % за Балінгом, - 1 л, агар - 20-25 г, стерильна крейда – 30 г. Стерилізують при 0,5 атм. 30 хв.

Капустяний агар з крейдою. Капустяний бульйон - 900 мл, дріжджовий екстракт – 100 мл, пептон – 10 г, глюкоза – 20 г, ацетат натрію – 3,35 г, МgSO₄ – 0,025 г, агар – 15—20 р. Стерильну крейду додають в колби з розрахунку 5 г на 200 мл середовища. Стерилізують при 0,5 атм. 30 хв.

Капустяний агар із спиртом і крейдою. В розплавлене і охолоджене до 50°С середовище додають 20 мл етилового спирту (96%-ного) на 200 мл середовища, ретельно збовтують і заливають в чашки Петрі з посівним матеріалом.

Пептонний агар. Пептон – 5 г, К₂НРО₄ – 1 г, КН₂РО₄ – 0,5 г, МgSO₄ – 0,5 г, NаСl – сліди, водопровідна вода – 1л, агар, добре промитий, - 15-20 г. Стерилізують при 1 атм. 20 хв.

Сусло-агар із стрептоміцином. Сусло, розбавлене до 3 % за Балінгом, - 1 л, агар - 25 г. Стерилізують при 0,5 атм. 30 хв. Перед розливанням середовища в чашки Петрі в сусло-агар додають 80-100 од. стрептоміцину на 1 мл середовища.

Підкислений сусло-агар. Сусло, розбавлене до 3 % за Балінгом – 1 л, агар – 20-25 г. Стерилізують при 0,5 атм. 30 хв. Перед розливом середовища в чашки Петрі в розплавлений сусло-агар додають прокип'ячену протягом 10 хв. на водяній бані молочну кислоту (2 мл на 1 л середовища).

Картопляне середовище з крейдою. В пробірки вносять стерильну крейду (на кінчику скальпеля), 8-10 картопляних кубиків величиною 2-3 мм заливають водопровідною водою до ³/₄ об'єму пробірок. Стерилізують при 1 атм 30 хв.

Середовище Ємцева. Картопляний крохмаль – 20 г, пептон – 5 г, дріжджовий автолізат – 0,2 мг/л, КН₂Р0₄ – 0,5 г, К₂НРО₄ – 0,.5 г, МgSO₄ - 0,5 г, NаС1—0,5 г, FеSO₄ – 0,01 г, МnSO₄ – 0,01 г, СаСОз – 10 г, суміш мікроелементів за М. В. Федоровим – 1 мл, дистильована вода - 1 л, тіогліколева кислота – 0,05 %, нейтральрот – 0,004 %, рН 7,4-7.5. Стерилізують середовище при 0,5 атм. 30 хв. Температура інкубації посівів 30-36 ºС.

Середовище Гільтая (видозмінене). Лимоннокислий натрій – 2 г, КNОз – 1 г, КН₂РО₄ – 4 г, К₂НРО₄ – 1 г. МgSO₄ – 1 г, СаСl₂ – 0,2 г, FеСl₃ - сліди, дистильована вода – 1 л, 1% розчин бромтимолового синього до рН 6,8—7,0. Стерилізують при 1 атм. 20 хв.

Середовище Кеслер. До 1 л водопровідної води додають 50 мл свіжої бичачої жовчі і 10 г пептону. Суміш кип'ятять 15 хв. на водяній бані, збовтують. Коли пептон розчиниться, фільтрують через вату, потім додають 10 г лактози. Після розчинення лактози встановлюють слаболужну реакцію (рН 7,6) і додають 4 мл 1%-ного водного розчину генціану фіолетового в пробірки з поплавками і стерилізують при 1 атм. 15 хв.

МПА і сусло-агар 1:1. Стерилізують при 0,5 атм. 30 хв.

Результати досліду______________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Висновки______________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Контрольні питання

1. За яких умов у кормах розмножуються мікроорганізми?

2. Які захворювання можуть викликати мікрорганізми, що розмножуються у неякісних кормах?

3. Які середовища використовують при бактеріологічному дослідження кормів?

4. Як відбирають проби сухих кормів?

5. Як відбирають проби силосу і в які фази дозрівання?

6. Як підготовляють проби кормів для бактеріологічних досліджень?

7. При яких умовах культивують проби кормів, які містять збудників мікозів і мікотоксикозів?

8. Як проводять мікроскопію грибів виділених із проб кормів?

9. Як проводять бактеріологічне дослідження силосу?

10. За наявністю чи відсутністю яких мікроорганізмів роблять висновок про якість силосу?