В.І. Семанюк, р.А. Пеленьо, і.Б. Турко, л.В.Шах Ветеринарно-Санітарна мікробіологія
Робочий зошит
Методичні вказівки для проведення лабораторних занять з курсу ,,Ветеринарно-санітарна мікробіологія”
Львів - 2012
Міністерство аграрної політики україни та продовольства
Львівський національний університет ветеринарної медицини
та біотехнологій імені С.З.Ґжицького
Кафедра мікробіології та вірусології
Робочий зошит
Методичні вказівки для проведення лабораторних занять з курсу ,,Ветеринарно-санітарна мікробіологія”
Львів - 2012
В.І. Семанюк, Р.А. Пеленьо, І.Б. Турко, Л.В. Шах. Робочий зошит. Методичні вказівки для проведення лабораторних занять з курсу ,,Ветеринарно-санітарна мікробіологія” - Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького. Львів. 2012. – 96 с.
Посібник сприятиме формуванню цілісного уявлення про проблеми і тенденції в галузі санітарно-мікробіологічного контролю за станом об'єктів навколишнього середовища і харчових продуктів.
Призначено для студентів вищих навчальних закладів ІІІ-IV рівнів акредитації, які навчаються за спеціальностями: "Ветеринарна медицина", "Технологія виробництва та переробки продукції тваринництва", "Технологія зберігання, консервування та переробки молока", "Технологія зберігання, консервування та переробки м’яса", "Екологія та охорона навколишнього середовища".
© В.І. Семанюк, Р.А. Пеленьо, І.Б. Турко, Л.В. Шах, 2012
Санітарно-показові мікроорганізми
Мета. Ознайомитися з санітарно-показовими (індикаторими) мікроорганізмами та освоїти методи їх індикації та ідентифікації.
Знати критерії за якими мікроорганізми можуть бути віднесені до санітарно-показових.
Вміти віді
Володіти
Теоретичне обгрунтування теми. Санітарно-показові мікроорганізми належать до індикаторних мікроорганізмів. Їх кількість характеризує санітарно-гігієнічну безпеку об’єктів навколишнього середовища і харчових продуктів тваринного і рослинного походження.
У даний час в категорію санітарно-показових (індикаторних) мікроорганізмів включені:
б а к т е р і ї г р у п и к и ш к о в и х п а л и ч о к (Б Г К П), в яку входять бактерії родів Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella;
е н т е р о к о к и, основним представником є Streptococcus faecalis;
с
Рис. 1. Стафілокок (а) і стрептокок (б) у чистій культурі
т а ф і л о к о к и, до яких належать S. aureus, S .epidermidis, S saprophyticus;с т р е п т о к о к и, до яких належать альфа- і бета-гемолітичні стрептококи;
к л о с т р и д і ї, основним представником є C. рerfringens;
б а к т е р і ї г р у п и п р о т е ю, найпоширенішими є P. vulgaris, P. mirabilis;
т е р м о ф і л и;
к о л і ф а г и.
Включення мікроорганізмів у групу санітарно-показових базується на таких принципах:
характерна (типова) локалізація в організмі людини чи теплокровних тварин, як і для патогенних мікроорганізмів;
шляхи надходження в об’єкти навколишнього середовища в кількості, що суттєво перевищує кількість патогенних;
спільні з патогенними способи поширення в об’єктах навколишнього середовища;
більш висока порівняно з патогенними стійкість до дії фізичних, хімічних і біологічних чинників і, як наслідок, більш високе виживання у навколишньому середовищі;
прості, доступні та надійні методи їх визначення, що дозволяють швидко отримувати результати і своєчасно проводити профілактичні заходи.
Отже, перевага використання санітарно-показових мікроорганізмів над безпосередньою індикацією патогенних мікроорганізмів полягає у нерівномірному поширенню останніх, а також тривалим часом і трудомісткістю методів їх дослідження.
Саме тому, при виборі санітарно-показових мікроорганізмів для конкретного об’єкта необхідно враховувати їхню індикаторну цінність відносно патогенних мікроорганізмів.
Індикаторний принцип нормування мікробного забруднення різних об’єктів запропонований Р. Кохом понад 100 років тому і на цей час є основним провідним принципом регламентації мікробного забруднення об’єктів навколишнього середовища.
Ґрунтуючись на цих положеннях, визначені різні санітарно-показові мікроорганізми залежно від конкретного об’єкта навколишнього середовища.
Індикаторами біологічного забруднення являються: для повітря приміщень – стрептококи і стафілококи (рис. 1); для грунту – БГКП, ентерококи, клостридії, термофіли; для води – БГКП, ентерококи, стафілококи; для предметів догляду – БГКП, стафілококи, ентерококи; для харчових продуктів – БГКП, ентерококи, стафілококи, бактерії групи протею.
Робота 1. Індикація та ідентифікація бактерій групи кишкової палички (БГКП)
Матеріальне забезпечення. Культури мікроорганізмів, вирощені на щільних і рідких живильних середовищах; фарби для фарбування за Грамом; мікроскопи.
Теоретичне обгрунтування. Для диференціації БГКП у зв’язку з їхнім неоднаковим санітарно-показовим значенням використовують такі тести: температурний (тест Ейкмана) визначають шляхом посіву досліджуваної культури мікробів на середовище Ейкмана (Кеслер, Буліра) із наступним культивуванням у термостаті при температурі 43–44 °С на протязі 24 год; індолоутворення – визначають шляхом посіву досліджуваної культури на МПА з використанням індикаторних папірців; реакція з метиловим червоним – визначають шляхом додавання до 3-5 денної культури, вирощеної на середовищі Кларка, декількох крапель індикатора метилового червоного. При рН 5,0 і нижче індикатор змінює колір із світло-жовтого на червоний; реакція на ацетилметилкарбінол (реакція Фогес-Проскауера) – визначають шляхом додавання до 5 мл 4-5 добової культури, вирощеної на пептонній воді з глюкозою або середовищі Кларка, такого ж об’єму 40% розчину КОН. При наявності ацетилметилкарбінолу (ацетоїну) середовище зафарбовується у рожевий колір; цитратний тест – визначають шляхом посіву досліджуваної культури на рідке середовище Козера або щільне середовище Сімонса з наступним культивуванням при 37 °С на протязі 24 год.; лактозний тест (зброджування лактози) –визначають шляхом посіву досліджуваної культури на знежирене молоко або пептонну воду з лактозою та наступним культивуванням у термостаті при 37 °С протягом 24 год.
Об’єднання перших букв тестів одержало назву – комплекс ТІМАЦЛ.
Проведення роботи. Провести диференціацію БГКП за тестами ТІМАЦЛ. Зробіть висновки.
Результати досліду______________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Висновки______________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Робота 2. Індикація та ідентифікація мікроорганізмів роду Proteus
Матеріальне забезпечення. Культури мікроорганізмів, вирощені на щільних і рідких живильних середовищах; фарби для фарбування за Грамом; мікроскопи.
Теоретичне обгрунтування. Виявлення бактерій групи протею проводять шляхом посіву по 0,1 мл десятикратних розведень досліджуваного матеріалу у конденсаційну воду свіжоскошеного МПА і наступного термостатування при 37 °С 18-48 год. Титр збудників визначають за здатністю найменшої кількості засіяного продукту давати ріст палички протею.
Проведення роботи. Із одержаних посівів мікроорганізмів роду Proteus виготовте мазки, виготовте мазок ,,висяча крапля”, інший мазок зафарбуйте за Грамом і прогляньте під мікроскопом. Зарисуйте. Зробіть висновки
Результати досліду
Висновки______________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Робота 3. Індикація та ідентифікація Clostridium perfringens
Матеріальне забезпечення. Культури мікроорганізмів, вирощені на щільних і рідких живильних середовищах; фарби для фарбування за Грамом; мікроскопи.
Теоретичне обгрунтування. Виявлення Clostridium perfringens проводять після прогрівання на водяній бані при 80 °С протягом 20 хв досліджуваної культури або продукту з наступним посівом на кров’яний агар, середовище Вільсон-Блера і знежирене молоко. Посіви вирощують 12-18 год. при 43 °С. Поява у середовищах змін вказує на наявність клостридій.
Проведення роботи. Прогляньте запропоновані кафедрою посіви Clostridium perfringens, визначають їхні морфологічні, тинкторіальні, культуральні і біохімічні властивості. Одержані дані запишіть у результатах досліду. Зробіть висновки.
Результати досліду
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Висновки______________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Робота 4. Лабораторна діагностика харчових бактеріальних отруєнь
Матеріальне забезпечення. Чашка Петрі з фаршем – 10 г; стерильна фарфорова ступка; пробірка з 2 г стерильного піску; колба з 50 мл стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду; колба з селенітовим середовищем – 40 мл; піпетки на 1-2 мл і 5-10 мл; чашки Петрі з середовищем Ендо; чашка з вісмут – сульфітним середовищем; пробірки зі свіжоскошеним МПА, із середовищем Кітт-Тароцці; пробірка з 6,5% сольовим бульйоном; чашки Петрі з кров’яним, молочно-сольовим і жовтково–сольовим агарами.
Теоретичне обґрунтування. Збудниками харчових отруєнь, які найчастіше виділяються з харчових продуктів, є сальмонели, ентеропатогенні ешерихії, протей, C. perfringens, ентерококи, патогенні стафілококи , Vibrio parahaemolyticus і Bacillus cereus.
Схеми дослідження харчових продуктів при бактеріальних отруєннях представлені у таблиці 1.
Таблиця 1. Схема дослідження харчових продуктів при бактеріальних отруєннях
Мікроорганізми, що виділяються із харчових продуктів |
Посів на живильні середовища у перший день дослідження |
Характер росту після первинного посіву |
Сальмонели |
1. Селенітовий бульйон 2.Вісмут-сульфітне середовище
3. Середовище Ендо |
1. Помутніння 2. Колонії з металевим блиском, іноді зеленуваті, зафарбовують у чорний колір середовище під колонією. 3. Безколірні або злегка рожеві колонії. |
Ентеропатогенні ешеріхії |
1. Середовище Ендо
2. Середовище Кеслер (для визначення колі-індексу) |
1. Ріст колоній червоного кольору з металевим блиском 2. Помутніння |
Протей |
1. МПА (за Шукевичем) |
1.Вуалеподібний (повзучий ріст) |
C. perfringens |
1. Середовище Сидоренко-Пивоварова |
1.Інтенсивне почорніння середовища |
Ентерококи |
1.Молочно-інгібіторне середовище з поліміксином і телуритом К |
1.Колонії правильної форми (1,5-2 мм) із зоною протеолізу чорного або сірого кольору |
Патогенні стафілококи |
3. Середовища збагачення: сольові бульйони з 6,5 і 10% NaCl; цукровий бульйон із 1% глюкози. |
1.Колонії правильної форми (2-4 мм); колір від білого до оранжево-жовтого; 2.Ореол коагуляту навколо колоній (дія ферменту лецитинази) 3. Дифузний ріст.
|
Vibrio parahaemoliticus |
1.ДДА. |
1.Колонії правильної форми з вологою блискучою поверхнею голубуватого кольору на аналогічному тлі середовища. |
Bacillus cereus |
1. Середовище Донована. |
1. Великі плоскі білі колонії зі злегка порізаними краями і зоною матового коагуляту. |
Примітка: Наступні виділення та ідентифікація чистої культури ведуться за звичайною схемою.
Проведення роботи. Виготовляють суспензію фаршу шляхом розтирання його у стерильній фарфоровій ступці із кварцовим піском та ізотонічним розчином натрію хлориду.
Для проведення лабораторної діагностики харчових бактеріальних отруєнь здійснюють посіви суспензії фаршу на селенітовий бульйон, на середовище Ендо, вісмут-сульфітне середовище, у конденсат скошеного агару (посів за Шукевичем), у середовище Кітт-Тароцці і термостатують.
Одержані результати порівняйте із даними табл. 1 і запишіть у результатах досліду. Роблять висновки.
Результати досліду______________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Висновки______________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________