12.2. Застосування методів тонкошарової та паперової хроматографії

У методі тонкошарової хроматографії (ТШХ) розділення речовин відбувається на пластинці, на яку нанесений тонкий шар адсорбента – стаціонарної фази. Найчастіше використовують скляні пластинки, але може бути і алюмінієва фольга, пластинка з полімерного матеріалу. Склад тонкого шару вибирають з урахуванням складу аналізованої проби. При виборі складу нерухомої фази слід врахувати полярність сорбента. Для розділення гідрофільних речовин сорбентами є силікагель, алюмогель, магній силікат, подрібнена целюлоза, водну суспензію яких розпилюють на тонку пластинку, а для кращого зв’язування додають гіпс або крохмаль, після чого висушують. Для розділення гідрофобних речовин використовується малополярний сорбент. У випадку, якщо пластинку не висушувати, то розділення речовин відбувається за механізмом розподільчої хроматографії, якщо висушити, то за механізмом адсорбційної. Рухома фаза переміщається шаром сорбенту під дією капілярних сил.

Вибір розчинника аналогічний до вибору в колонковій адсорбційній хроматографії – за елюотропними рядами.

Метод ТШХ характеризується високою ефективністю та низькою межею виявлення, ним можна розділити від декількох мг до 5 мкг речовин, для визначення достатній мінімальний об’єм проби.

Для розділення речовин аналізований розчин наносять на пластинку градуйованим мікрошприцом (мікропіпеткою), зазначають лінію старту графітовим олівцем. Проба мусить містити достатньо речовини, щоб під час проявлення вміст її становив 0,5-10 мкг у точці плями. Пластинку поміщають у закриту камеру, насичену парами розчинника. Після завершення розділення олівцем зазначають лінію поширення розчинника – лінію фінішу.

Застосовують два варіанти хроматографії. При висхідному варіанті розчинник з дна камери поступає на низ пластинки і поступово піднімається, насичуючи нерухому фазу – речовини переміщаються знизу вверх. При низхідній хроматографії розчинник подають на верх пластинки і він поступово переміщається вниз, при цьому до капілярної сили додається сила гравітації. Цей спосіб застосовують у випадку речовин, які дуже повільно переміщаються в шарі сорбента.

Після хроматографічного розділення пластинку виймають з камери, просушують. Якщо речовини безбарвні, то хроматограму проявляють, сприскуючи специфічними реактивами. Якщо нема відповідних реактивів, то використовують реакцію на крохмаль чи целюлозу, яка є в складі сорбента: пари J₂, розчин йоду, KMnO₄. Іноді до сорбента додають люмінофор. Тоді при опроміненні пластинки УФ-випромінюванням сорбент флуоресціює, а плями з розділеними речовинами – ні, на їх місці видно темні плями. Розділення методом тонкошарової хроматографії подібне на розділення методом паперової, показаної на рис. 12.4.

Для більш повного розділення можна застосувати двомірне хроматографічне розділення. Після того як речовини розділились на хроматограмі на окремі зони, у перпендикулярному напрямку діють іншим розчинником – наступає ще більш повне розділення, причому в двох різних розчинниках.

Якісний склад визначають за параметром утримування R_f, який залежить від фізико-хімічних властивостей речовини, рухомої фази і сорбента та від температури:

, де L – шлях проходження від старту до плями.

Кількість визначають після проявляння хроматограми.

• Можна визначати кількість за площею плями речовини після розділення досліджуваної та стандартної суміші. Якщо використовують серію стандартних сумішей, то будують градуйований графік , прямолінійний у межах вмісту інгредієнта 1-80 мкг.

• Вимірюють інтенсивність відбитого світла від плями речовини на хроматограмі досліджуваної та стандартної суміші спектроденситометром.

• Вимірюють мікрофотометром інтенсивність світла, яке пройшло через пляму речовини на хроматограмі досліджуваної та стандартної суміші.

• Пляму з пластинки зішкрібають та переносять у склянку, елююють речовину відповідним розчинником. Визначають вміст речовини у розчині.

Методом тонкошарової хроматографії визначають вміст барвників у продуктах харчування, причому не потрібно використовувати проявника.

Під час виробництва цукру контролюють процес гідролізу – вміст глюкози, фруктози.

Визначають вміст формальдегіду у стоках цукрового виробництва. Відходи цукрового виробництва містять компоненти біохімічних реакцій, серед яких забруднювачі – альдегіди, органічні кислоти, які є шкідливими. У жомі, мелясі та цукрі міститься багато формальдегіду, який визначають методом тонкошарової хроматографії. Однак, спочатку карбонільні леткі речовини переводять у кристалічні сполуки, які легко відділяються від інших органічних речовин.

Мелясу змішують з водою та CCl₃COOH і екстрагують з неї формальдегід, потім його відганяють. Леткий формальдегід вловлюють димедоном і перетворюють у нелеткий формальдимедон, з якого готують серію стандартних розчинів.

Формальдимедон екстрагують хлороформом два рази і пропускають через колонку з активованим вугіллям для очистки, потім пропускають через колонку з Na₂SO₄ для просушування. Одержаний розчин трохи випаровують.

На хроматографічну пластинку наносять підготовлену пробу, що містить формальдимедон, а також проби стандартів і проводять розділення, пропускаючи через пластинку хлороформ. Після просушування пластинку проявляють розчином J₂ у хлороформі.

Кількість формальдегіду визначають, порівнюючи площі плям досліджуваного та стандартного розчинів.

Визначення консервантів у напоях. Соки та сиропи консервують дією бензойної кислоти С₆Н₅СООН, яка може трансформуватися у шкідливу для людини гіпурову кислоту. Сама бензойна кислота практично не піддається ферментному окисненню, не входить в обмінний цикл Кребса. Тому необхідно контролювати вміст бензойної кислоти.

До соку (сиропу) додають 1М H₂SO₄ та Na₂SO₄, після чого бензойну кислоту екстрагують бутилацетатом, а потім екстракт сушать над Na₂SO₄ в ексикаторі. Наносять екстракт на пластину, додають розчин НСООН та Н₂О₂ і підсушують. При цьому відбувається окиснення С₆Н₅СООН в п-НО-С₆Н₅СООН. Одержану суміш розділяють дією суміші петролейного та діетилового ефірів у хлороформі. Виявляють п-НО-С₆Н₅СООН в УФ світлі при =254 нм, яка на флуоресціюючому фоні дає темну пляму. Для кількісного виявлення зішкрібають пляму та елююють п-НО-С₆Н₅СООН етилацетатом.

Аналізують також суміш бензойної і сорбінової кислот, якими консервують безалкогольні напої. Перед розділенням ці кислоти екстрагують етилацетатом, осушують. В умовах, як описано вище, кислоти розділяють на пластинці. Якісно виявляють кислоти за коефіцієнтом утримування R_f, а кількісно – за відсутністю флуоресценції в УФ-випромінюванні.

Метод тонкошарової хроматографії застосовують для ідентифікації складових біохімічних препаратів, ліків.

Можуть бути інші різновиди тонкошарової хроматографії – гель-хроматографія, іонообмінна хроматографія.

Застосування паперової хроматографії. Хроматографія на папері належить до різновидів розподільчої хроматографії. Принцип методу полягає в розподілі речовин між двома рідкими фазами, одна з яких, нерухома, закріплена на поверхні очищеного підготовленого фільтрувального паперу, а інша є рухомою. Через велику гігроскопічність паперу його волокна вкриті тонким шаром вологи (у повітряно-сухому стані папір містить до 20% води). Фактично нерухому фазу представляє вода, а рухомою є органічний розчинник або їх суміш.

Розчинники нерухомої та рухомої фаз повинні не змішуватись, а розчинність речовин повинна бути кращою у рухомій фазі.

Для розділення органічних речовин, які не розчиняються або мало розчиняються у воді, потрібно папір попередньо обробити гідрофобними речовинами (парафіном, силіконовими полімерами).

Процедура розділення подібна до процедури в методі тонкошарової хроматографії. Для розділення краплю розчину наносять на точку старту на хроматографічному папері (рис.12.4). Нижній край паперу занурюють у розчинник (рухливу фазу). Під час переміщення розчинника переміщаються також і речовини, які потрібно розчинити. Коли розчинник пройде через усю смугу паперу, то олівцем зазначають лінію фінішу, папір підсушують і проявляють.

Рис.12.4. Розділення методом паперової хроматографії:   точка старту (нанесення досліджуваної суміші); l1, l2  шлях, який пройшли речовини 1 і 2; L  шлях, пройдений розчинником

Складні суміші можна розділяти двомірною хроматографією на квадратному листі паперу. Спочатку в один кут квадрата поміщають розчин, і папір одним боком контактує з рухомою фазою. Після завершення розділення повертають папір на 90 і другим боком контактують з іншим розчинником. Таке розділення є більш повним.

Якісне виявлення проводять за коефіцієнтами утримування речовин.

Для кількісного визначення використовують характеристики плям на хроматограмі:

• порівнюють площу плями компонента на хроматограмі розділюваної та стандартної суміші;

• для люмінесціюючих речовин кількість оцінюють за інтенсивністю люмінесценції;

• елююють забарвлену речовину з плями та визначають іншими фізико-хімічними методами.

Паперовою хроматографією розділяють та ідентифікують як неорганічні, так і органічні речовини, біологічні суміші. У харчовій промисловості цим методом контролюють технологічний процес та якість готової продукції.

Метод паперової хроматографії селективний, має низьку межу виявлення, для аналізу достатньо декілька мкг зразка.

Методом паперової хроматографії виявляють глюкозу, яка є в суміші з іншими вуглеводами у водному розчині. Розділення проводять повільно, впродовж 2 год. Після висушування хроматограму проявляють спиртовим розчином резорцину та HCl – блідо-рожева пляма відповідає глюкозі. Кількість глюкози визначають за площею плями, виміряної планіметром, або за масою вирізаної плями.

Вміст амінокислот та їх кількість контролюють у розчинах, одержаних при гідролізі білків.

Попередньо папір оброблюють упродовж 36-48 год розчином 8-гідроксихіноліну для зв’язування важких металів.

Амінокислоти розділяють на папері дією бутилового спирту та ацетатної кислоти у воді. Хроматограму висушують, проявляють розчином нінгідрину в н-бутиловому спирті, при цьому з’являються блідо-рожеві плями. Розміщення амінокислот згідно величин параметрів утримування таке: серин, гліцин, аланін, триптофан, метіонін, валін, фенілаланін, лейцин.

Для кількісного визначення вмісту амінокислот (на прикладі суміші аспарагінової, глутамінової та валіну) після нанесення розчину спочатку папір насичують на 2/3 довжини розчинником, висушують, а потім ще раз пропускають розчинник (всього три рази). Після проявлення нінгідрином розташування амінокислот наступне: аспарагінова, глутамінова, валін.

Плями вирізають з паперу, подрібнюють папір ножицями. Кусочки паперу вносять у пробірки з розчином екстрагента (510^-4 % розчин CuSO₄ в етиловому спирті) і залишають на 2 год. Одержується оранжевий розчин комплекса Cu²⁺ з амінокислотою, який фотометрують при =530 нм.

Визначення вмісту органічних кислот у хлібі. Для виготовлення хліба біохімічно одержують кисле тісто. Кислоти (лактатна, яблучна, цитратна, тартратна) містяться в заквасці, заварці та у м’якоті. Недостача чи надлишок кислот впливають на смак і якість хліба.

Хліб подрібнюють, з нього дією ізопропілового спирту екстрагують кислоти (R’COOH).

Одержаний екстракт очищають від катіонів, пропускаючи розчин через колонку з катіонітом R-H⁺:

nR-H⁺ + Меⁿ⁺  R_n-Ме⁺ + nH⁺_.

У колонці з аніонітом R-OH з розчину затримують аніони карбонових кислот:

R-OH + R’COOH  R-OOCR’ + H₂O.

Кислоти з колонки видаляють пропусканням розчину NaOH – одержуються натрієві солі кислот:

R-OOCR’ + Na⁺OH^- R-OH^- + R’COO^-Na⁺.

Натрієві солі перетворюють у кислоти, пропускаючи розчин через катіоніт R-H⁺ та елююють їх дистильованою водою (до нейтральної реакції):

R-H⁺ + R’COO^-Na⁺  R-Na⁺ + R’COOH.

Кислоти з одержаного розчину розділяють на папері, пропускаючи розчинник (н-бутиловий спирт з форміатною кислотою та водою у співвідношенні 10:2:5). Проявляють хроматограму розчином індикатора бромфенолового синього. Кількість кислот можна визначити за площею плям: S = f(lgC_кислот).

Визначення карбонільних сполук у хлібі. Під час випікання хліба при високій температурі утворюються альдегіди, які надають йому запах. Альдегіди відганяють під вакуумом з водяною парою і поглинають розчином 2,4-динітрофенілгідразину. Утворюються гідразони, які розділяють методом паперової хроматографії.

Спочатку порцію хліба розмочують у воді (1:2,5) і витримують при низькій температурі (3-4С) півгодини. У колбі для вакуумної відгонки при температурі 40-50С протягом години відганяють альдегіди, вловлюють їх насиченим розчином 2,4-динітрофенілгідразину в HCl, охолодженим льодом. Цю суміш витримують протягом 12-15 год. Одержуються гідразони, які екстрагують бензолом 4-5 разів. Бензол відганяють під вакуумом.

З гідразонів готують стандартні розчини з концентрацією 0,01-0,06 г/л.

Розчин гідразонів наносять на папір, підсушують. Папір насичують сумішшю розчину формаміду з метиловим спиртом та поміщають в камеру для хроматографування. Суміш розділяють дією циклогексану протягом 3 год.

Для кількісного визначення плями вирізають, переносять у пробірки з етиловим спиртом та витримують 5 год. Одержуються забарвлені розчини, які фотометрують при =500 нм.