1. Виділення вірусу при його внутрішньоклітинному культивуванні.

2. Визначення в крові вірусних антигенів чи провірусної днк.

3. Визначення специфічних антитіл до вірусу.

Першим етапом скринінгу ВІЛ-інфекції є імуноферментний аналіз (ІФА) ELISA (enzyme - linked immunosorbent assay). Принцип методу полягає у визначенні в сироватці крові сумарних антитіл до ВІЛ за допомогою твердофазового ІФА. "Поріг", що визначає позитивний результат, виявляється на низькому рівні. Це робить тест чутливим, але збільшує кількість хибних результатів, оскільки білки сироватки мають здатність інтерферувати зі специфічними антитілами до ВІЛ. Якщо при ELISA отримано позитивний результат, то проводять 2 повторних дослідження цим самим методом. При двох повторних негативних результатах кров можна вважати неінфікованою. Якщо при одному чи двох дослідженнях повторюється позитивний результат, його перевіряють на другому етапі - стадії експертної діагностики за методом імуноблотингу. Цей метод дозволяє виявити наявність антитіл до індивідуальних протеїнів ВІЛ.

Для уточнення діагнозу ВІЛ-інфекції вирішальне значення має виділення вірусу. На практиці це пов'язано з рядом проблем. Серед них можна виділити широку варіабельність рівня віремії у хворих та дороговизну культивування і накопичення ВІЛ у значних кількостях.

Ідентифікація вірусних антигенів здійснюється в культурах лімфоцитів за допомогою методів молекулярної гібридизації (виявлення нуклеїнових кислот ВІЛ), визначення активності зворотної транскриптази як маркерного ферменту ретровірусів.

Проте найспецифічнішим методом є ланцюгова полімеразна реакція (ЛПP), яка дозволяє визначати не антитіла до білків ВІЛ, а генетичний матеріал вірусу. Це є особливо важливим у випадку вертикальної трансмісії, коли антитіла обов'язково присутні в крові і інфікованої, і неінфікованої дитини до 18- місячного віку.

Метод підрахунку СД4+-клітин на даний час є показником ризику ускладнень BIJI-інфекції. Встановлено, що ризик розвитку СНІДу і смерті в найближчі 24 місяці у хворих із кількістю СД4+-клітин більше 500 в 1 мкл становить 5%, а у осіб із кількістю менше 50 в 1 мкл - 70 %.

Визначення рівня РНК – «вірусного навантаження» - є одним із найважливіших прогностичних маркерів перебігу захворювання. Визначають вірусну РНК молекулярними методами (за допомогою ДНК-зондів). Відсоток виявлення вірусу у плазмі ВІЛ-інфікованих збільшується залежно від стадії захворювання.

Важливим є той факт, що практично у всіх ВІЛ-інфікованих дітей, які не отримували антиретровірусну терапію, визначається високий рівень вірусної РНК у плазмі незалежно від клінічної стадії захворювання.

Визначення «вірусного навантаження» дозволило встановити взаємозв'язок між рівнем ВІЛ у плазмі та клінічною стадією захворювання та контролювати такі показники:

• ризик прогресування захворювання;

• необхідність початку антиретровірусної терапії;

• контроль ефективності антиретровірусної терапії.

Найскладнішою є діагностика ВІЛ-інфекції у дітей раннього віку, яких народили ВІЛ-інфіковані жінки. За наявності ВІЛ-інфекції у вагітної відбувається трансплацентарне проникнення антитіл (імуноглобулінів класу G) до плода. Але не кожна дитина, народжена ВІЛ-інфікованою матір'ю, інфікована ВІЛ. Перинатальна (антенатальна та інтранатальна) трансмісія ВІЛ-інфекції, а також зараження дитини при годуванні груддю спостерігається в 8-50 % випадків. При цьому антитіла до ВІЛ спостерігаються у всіх дітей, народжених ВІЛ-інфікованими жінками, до 18-місячного віку, а в деяких випадках і довше. Таким чином, стандартні серологічні методи діагностики - імуноферментний твердофазний аналіз ELISA та імуноферментний аналіз - не дають однозначної оцінки інфекційного статусу дитини до 18-місячного віку.

У дітей раннього віку клінічна діагностика ВІЛ-інфекції також складна. Погане збільшення маси тіла, гіпертермія, збільшення лімфовузлів, гепато- та спленомегалія не є специфічними ознаками ВІЛ-інфекції.

Тактика досліджень повинна базуватися на максимально ранньому тестуванні новонароджених дітей протягом перших 48 годин після народження. Сучасна діагностика ВІЛ - інфекції у дітей до 18 місяців життя включає:

- визначення вірусних нуклеїнових кислот методом ЛПP;

- виділення культури ВІЛ.

У світовій практиці діагноз вважається достовірним при позитивному результаті обох названих тестів або повторному позитивному результаті одного з цих досліджень.

ЛПР дозволяє виявити геномні послідовності вірусної РНК і провірусної ДНК, це високочутливий специфічний метод. Удосконалення технології ЛПР дає можливість використовувати її не тільки для якісної діагностики ВІЛ - інфекції, а також для визначення копій вірусної РНК у плазмі крові, що важливо при призначені моніторінгу антиретровірусної терапії у дітей та дорослих.

При неможливості виявлення ВІЛ у дитини віком до 18 місяців за допомогою зазначених методів, її обстежують на анти- ВІЛ- антитіла.

ВІЛ - інфікованими слід вважати дітей, що мають позитивні: ВІЛ - культуру, або ЛПР, або р24 антиген, або позитивний результат обстеження на антитіла до ВІЛ, визначені методом ІФА та підтверджені імуноблотингом.

В обстеження дитини також входить обов'язкове визначення кількості лімфоцитів та їх субпопуляцій, насамперед СД4+ у віці до 1 міс., потім кожні три місяці. Оцінка показників СД4+ проводиться з урахуванням їх вікової кількості.

Дані загальноприйнятих лабораторних досліджень неспецифічні. При ранніх проявах ВІЛ - інфекції найчастіше виявляються поліклональна гіпергамаглобулінемія, тромбоцитопенія, лейкопенія з нейтропенією, анемія. У деяких дітей підвищується рівень трансаміназ. Показаний моніторінг біохімічних показників крові, зокрема, білірубіну, трансаміназ, креатініну.

У 1995 році Європейський центр епідеміологічного моніторингу СНІДу запропонував такі критерії постановки діагнозу ВІЛ-інфекції у дітей:

A. Дитина вважається інфікованою, коли:

1) - у дитини до 18-місячного віку є антитіла до ВІЛ;

- дитина народжена ВІЛ-позитивною матір'ю;

- при отриманні позитивних результатів при двох незалежних дослідженнях (але не пуповинної крові) з виявлення ВІЛ: отримана культура ВІЛ, позитивна ЛПР, виявлено антиген ВІЛ.

2) Дитина старше 18 міс. і яка народжена серопозитивною матір'ю (мати отримувала переливання крові чи її компонентів, чи у неї виявлено інший шлях передачі (статевий контакт і т.д.), якщо у дитини визначаються антитіла до ВІЛ, або позитивні тести, як і у п.1.

Б. Інфекційний статус дитини вважається невизначеним, хоча є ризик перинатальної передачі, але немає вищезгаданих критеріїв інфікованості, і при цьому:

- дитина серопозитивна при проведенні ІФА та підтверджувального тесту, і їй немає 18 місяців на момент обстеження;

- дитина народжена від інфікованої матері, але немає даних про результати обстежень на антитіла до ВІЛ.

B. Дитина вважається неінфікованою, хоча народилася від серопозитивної матері, але при цьому:

- задокументовано 2 і більше негативних досліджень на визначення антитіл до ВІЛ в ІФА у віці від 6 до 18 місяців чи є негативний результат у віці 18 місяців і старше;

- немає інших лабораторних підтверджень інфекції (2 позитивних тестів на визначення вірусу, якщо вони проводилися);

- немає захворювань, які свідчать про розвиток СНІДу.

Моніторинг дітей, народжених ВІЛ-інфікованими матерями.

Комітет СНІДу Американської академії педіатрії (1997) рекомендує такий лабораторний моніторинг дітей, народжених ВІЛ-інфікованими матерями:

у перші 6 місяців життя:

- оцінка ризику інших захворювань (сифіліс, токсоплазмоз, гепатит В, цитомегалія) відразу після народження чи в максимально короткий термін;

- розгорнутий клінічний аналіз крові з обов'язковим визначенням лейкоцитарної формули і тромбоцитів щомісячно;

• профіль Т-лімфоцитів (СД4+, СД8+) у віці 1 і 4 місяців;

• ЛПР для ДНК ВІЛ і/або культура ВІЛ у перший місяць і в 3 місяці;

- рівні імуноглобулінів у 4 місяці.

у дітей старше 6 місяців:

• кількість Т-лімфоцитів (СД4+, СД8+) кожні 3-6 місяців;

• рівні імуноглобулінів 1 раз на 6 місяців;

• визначення активності печінкових ферментів (помірне їх підвищення при ВІЛ-інфекції) кожні 3-6 місяців;

- рентгенографія органів грудної клітки 1 раз на 6 місяців;

- нейросонографія 1 раз у 6 місяців.

При клінічній інтерпретації кількості СД4+ Т-лімфоцитів у дітей необхідно враховувати вікову варіабельність показника. Кількість СД4+ Т-лімфоцитів у здорових дітей без ВІЛ-інфекції є достовірно вищою, ніж у здорових дорослих. Протягом перших 6 років життя цей показник поступово зменшується і стає таким, як у дорослих. Зниження відсотка СД4+ Т-лімфоцитів є маркером прогресування ВІЛ-інфекції і свідчить про поганий прогноз для дитини. Ідентифікація імунологічної категорії важлива для проведення терапії, тому цей показник необхідно визначати кожні 3 місяці. Виявлення у немовлят патологічного імунологічного профілю (число СД4+ <1900 в 1 мкл і число СД8+ >850 в 1 мкл) протягом перших 6 місяців свідчить про швидке прогресування хвороби.

Вірусне навантаження в периферичній крові при перинатальному інфікуванні відрізняється від відповідного показника у дорослих.

При народженні дітей з перинатальною трансмісією ВІЛ спостерігається низький рівень РНК ВІЛ у плазмі крові. Різке збільшення кількості копій відбувається протягом перших 2 місяців, потім відмічається повільне зниження вірусного навантаження протягом першого року життя. За різними літературними даними рівень РНК ВІЛ більше 100000 299000 копій у 1 мкл у дитини молодше 12 міс. може корелювати з прогресуванням захворювання і високим ризиком смерті. Дослідження числа копій РНК ВІЛ, абсолютного числа і відсотка СД4+ Т-лімфоцитів є важливим критерієм для початку і зміни терапії.