Материально-техническое оснащение

1. Инструменты и оборудование: набор ингредиентов для приготовления основных питательных сред, набор сухих питательных сред, дистиллированная вода, среда Гисса, Эндо, Сабуро, кровяной агар, ПА, ПБ, штативы, чашки Петри, пробирки, бактериальные петли, поплавки, индикаторные бумажки для выявления сероводорода и индола, углеводы (сахароза, глюкоза, манноза, галактоза, лактоза), индикатор Андреде.

2. Схемы и таблицы: «Схема механизмы питания бактерий», «Среды Гисса», «Эшерихии и сальмонеллы на среде Эндо», «Изучение биохимической активности микроорганизмов».

Контрольные вопросы.

1. Как делятся бактерии по типу усвоения углерода?

2. Как делятся бактерии по типу усвоения азота?

3. Назовите основные механизмы питания бактерий.

4. Какие требования предъявляются к питательным средам?

5. Как делятся питательные среды по происхождению и назначению? Приведите примеры.

6. Чем отличаются основные среды от селективных и специальных по составу?

7. Какие вы знаете ферменты бактерий? Примеры.

8. Как ферментативную активность бактерий используют для их идентификации?

9. Какие среды используют для выявления сахаролитических ферментов? С какой целью используют поплавки в среде Гисса?

10.На чем основан принцип применения индикатора Андреде?

11.Какие среды используют для выявления сахаролитических, липолитических, протеолитических ферментов?

12.Какие Вы знаете пигменты бактерий? Их роль для бактерий?

Выполнение лабораторной работы

1. Изучить рецептуру сухих питательных сред.

2. Оценить результат выявления сахаролитических и протеолитических ферментов у чистых культур энтеробактерий/стафилококка на среде Гисса/тест-системах по демонстрационному посеву.

3. Изучить набор культур образующих пигмент.

4. Оформить протокол.

Правила оформления протокола

1. Ответить письменно на контрольные вопросы.

2. Составить таблицу с рецептурами питательных сред (название, состав, способ приготовления, стерилизации, назначение) используя демонстрационный набор. Выделить базовые и дополнительные компоненты. Написать их назначение.

3. Представить графически (алгоритм исследования) биохимических свойств.

4. Учесть результаты опыта определения биохимической активности энтеробактерий (стафилококка) с использование сред Гисса и тест-систем для идентификации: записать название субстрата, отметить наличие/отсутствие фермента, определить вид микроорганизма.

5. Составить таблицу пигментообразующие бактерии с указанием химической группы, цвета и растворимости пигмента (в воде/органических растворителях).

Дополнительный материал

Питательные среды. Левином и Шенлейном еще в 1930 г. было классифицировано более 2000 наименований питательных сред для культивирования микроорганизмов, но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико.

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азот, углерод. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды. Кроме этого, микробам необходимы неорганические соединения макро- и микроэлементы. Они выполняют роль катализаторов химических процессов и необходимы в ничтожно малых количествах (поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой).

По характеру усвоения азота патогенные микроорганизмы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты неполного ферментативного переваривания белков. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии неизмененного белка.

Источником углерода для патогенных бактерий являются, главным образом, различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли. Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, KH₂PO₄, K₂HPO₄ и т. д.

Ростовые факторы, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.

Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.

Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.

По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ - агара или желатина. Агар-агар (по - малайски – желе) — продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей.

Требования, предъявляемые к питательным средам. Питательные среды должны: содержать необходимые для питания микроба питательные вещества, иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба, иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса, быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов, обладать изотоничностью.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.

К первой группе относятся пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба.

К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические.

Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной.

В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.

Методы изучения ферментов. В бактериологической практике для идентификации микроорганизмов изучают наличие сахаролитических и протеолитических ферментов. Чаще других используют среды Гисса с моно- и дисахарами (лактоза, глюкоза, мальтоза, сахароза, арабиноза, ксилоза фруктоза, галактоза) и спиртами — (маннит, дульцит, глицерин и др.). При разложении этих продуктов происходит образование органических кислот (уксусной, молочной), нейтральных продуктов и газа (СО₂, Н₂). Накопление кислот ведет к изменению рН и цвета индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью), присутствующего в среде. Среды разливают по 5 мл в пробирки с поплавками и стерилизуют. Для определения ферментативной активности бактерии засевают петлей, посев на 24-48 часов помещают в термостат. Иногда учет результатов ведут в течение 10 суток. При сбраживании сахара среда краснеет, а газ, как уже отмечалось, скапливается в поплавке.

Для определения протеолитических ферментов производят посев уколом в столбик 10% желатины и посев в пептонную воду для выявления продуктов расщепления аминокислот до аммиака, индола, сероводорода. Реакция на аммиак – лакмусовая бумажка помещается под пробку. Посинение лакмусовой бумажки свидетельствует о наличии аммиака. Реакция на индол используют реактив Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобезандельгид с хлористоводородной кислотой) розовое окрашивание реакция положительная. Реакция на сероводород бумажка обрабатывается сульфатом железа черное окрашивание положительный результат.

Тест на каталазу на предметное стекло наносят каплю 3% перекиси водорода и затем петлей вносят культуру бактерий. Образование пузырьков (каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду) - тест положительный.

Тема лабораторного занятия: Методы культивирования и выделения чистой культуры аэробов.

ЦЕЛИ: знать основные типы дыхания бактерий, принципы культивирования и выделения чистой культуры аэробов; уметь обосновывать выбор условий для культивирования и выделения чистых культур бактерий, выделения чистой культуры строгих аэробов.