Правила оформления протокола

1. Ответить письменно на контрольные вопросы.

2. Записать результаты демонстрационного опыта определения чувствительности штамма стафилококка к антибиотикам диско-диффузионным методом: определить величину зон задержки роста стафилококка (в мм), дать оценку чувствительности штамма к антибиотикам, используя специальную таблицу.

3.Рассчитать величину терапевтического индекса, дать заключение о клинической эффективности бензилпенициллина для лечения больного.

4.Зарисовать строение бактериофагов по демонстрационной таблице.

5.Записать результаты опыта титрования бактериофага на жидкой и плотной питательных средах. Определить титр фага.

6.Дать характеристику диагностическим и лечебно-профилактическим препаратам бактериофагов.

Дополнительный материал

Титрование фагов. Активность препарата фага определяется его титром. Титр фага - наибольшее его разведение, еще вызывающее лизис чувствительной культуры бактерий. Фаги титруют следующими методами: 1) на жидкой питательной среде, 2) на плотной среде.

Схема титрования бактериофага на жидкой

Ингредиен- ты	Разведение фага								КК	КФ
	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	10-8
Питатель- ный бульон, мл Титруемый фаг, мл	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 -	4,5 0,5
Суточная культура бактерий, в каплях	1	1	1	1	1	1	1	1	1	-

Термостат +37⁰С, 18-20 часов.

Примечание: КК - контроль культуры,

КФ - контроль фага.

1) Готовят последовательные десятикратные разведения испытуемого фага в жидкой питательной среде: 10^-1, 10^-2, 10^-3, и т.д. Для этого в ряд пробирок вносят 4,5 мл питательного бульона. Затем в первую пробирку вносят 0,5 мл титруемого фага, получают первое разведение фага 10^-1; содержимое 1-й пробирки перемешивают и 0,5 мл из первой пробирки переносят во вторую пробирку, получают разведение 10^-2 и т.д. до разведения 10^-8 . Из последнего разведения 0,5 мл выливают в дез. раствор. После приготовления разведений к каждому разведению добавляют чувствительную культуру бактерий. Пробирки инкубируют в термостате при +37⁰С 18-20 часов. После инкубации отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис чувствительной культуры (рост бактерий в этой пробирке отсутствует). Это разведение, и является титром фага. Например: «Титр фага – 10^-6».

2) Титрование фага на плотной питательной среде. Чашку с плотной средой делят на несколько зон. Культуру чувствительных бактерий высевают сплошным газоном на поверхность среды. Затем в соответствующие зоны наносят по капле различных десятикратных разведений фага. После инкубации в термостате при +37⁰С 18-20 часов отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис чувствительной культуры (образование «стерильного пятна»).

Практическое применение фагов в медицине. Вирулентные фаги применяют для:

а) лечения и экстренной профилактики (при угрозе заражения) инфекционных заболеваний. Например: брюшнотифозный, дизентерийный, холерный Эль-Тор, коли – протейный, стафилококковый, гангренозные, синегнойный и др. фаги.

Б) диагностики с целью установления вида неизвестного микроба используются видовые фаги. Ставится опыт «43ани» на плотной питательной среде. Например: неизвестную чистую культуру высевают сплошным газоном на чашку с плотной средой, на которую наносят каплю известного видового фага и инкубируют в термостате. Если культура бактерий соответствует данному фагу, в месте нанесения фага образуется «стерильное пятно» (зона лизиса культуры фагом).

В) фаготипирования с целью установления источника заражения применяются типовые фаги, например при изучении внутрибольничных вспышек инфекционных заболеваний, вызванных стафилококками. Если штаммы, выделенные от больного и предполагаемого источника инфицирования лизируются одними и теми же типовыми фагами, это означает, что обе культуры принадлежат к одному фаговару, следовательно, имеют общее происхождение.

Применение умеренных фагов:

а) на лизогенных бактериях изучают механизмы функционирования различных генов; с помощью трансдукции устанавливают локализацию генов на бактериальной хромосоме.

Б) лизогенные бактерии используются при поисках противоопухолевых веществ: если препарат обладает индуцирующими свойствами, т.е. вызывает переход профага в продуктивную форму (активную, инфекционную), следовательно, точкой приложения или действия этого препарата является нуклеиновая кислота, и препарат можно испытывать как противоопухолевый препарат.

В) лизогенные штаммы используют при изучении различных мутагенных факторов, например, в космических исследованиях – как индикаторы надежности защиты космических кораблей от жестких космических лучей: если по возвращению из космоса произошла индукция, и культура лизирована, следовательно, в корабль проникли космические лучи, т.е. защита корабля ненадежна.

Г) умеренные фаги широко используются в генной инженерии. Модель «профаг – клетка» лежит в основе вирусогенетической гипотезы происхождения опухолей

Концентрации антибиотиков в крови (К, мкг/мл) после введение средне-терапевтических доз препарата.

Антибиотик	К	Антибиотик	К
Ампициллин	15-25	Полимиксин В	10-15
Бензилпенициллин	0,52(ЕД/мл)	Рифампицин	15-25
Ванкомицин	10-15	Стрептомицин	20-25
Гентамицин	6-8	Тетрациклины	3-5
Канамицин	15-20	Тобрамицин	6-8
Линкомицин	10-15	Фузидиевая кислота	10-20
Метициллин	10-15	Хлорамфеиикол	5-10
Оксациллин	4-6	Цефалексин	15-25
Олеандомицин	3-5	Эритромицин	3-5

Методы определения чувствительности к антибиотикам.

1. Метод серийных разведений. Методом серийных разведений МИК антибиотика определяют по минимальной концентрации антибиотика, задерживающей видимый рост микроорганизма в пробирках или на чашках с питательной средой, содержащих убывающие концентрации антибиотика.

Например, для определения МИК тетрациклина в отношении культуры Staphylococcus aureus, выделенной от больного, готовят двух кратно убывающие концентрации этого антибиотика в стандартном питательном бульоне. Контролями культуры и антибиотика являются, соответственно, бульон без антибиотика и бульон с первым разведением антибиотика. В опытные и контрольные пробирки вносят стандартизованную суспензию молодой агаровой культуры S. Aureus и после суточной инкубации учитывают результат.

Учетным признаком является наличие или отсутствие мутности бульона (роста культуры) в пробирках. В контроле культуры должна быть мутность, в контроле антибиотика – нет. Величина МИК соответствует той минимальной концентрации тетрациклина, при которой отсутствует видимый рост возбудителя (бульон в пробирке прозрачный). Допустим, бульон будет мутным в опытных пробирках с концентрациями, 2, 4 и 8 мкг/мл, а в пробирках с концентрациями 16, 32 и 64 мкг/мл прозрачным. В этом случае МИК тетрациклина = 16 мкг/мл. Известно, что величина К тетрациклина при введении средне-терапевтических доз – 4 мкг/мл (при использовании максимальных доз – 10 мкг/мл). Следовательно, в данном случае терапевтический индекс будет равен Т = 16:4 = 4 (> 0,3), т.е. возбудитель устойчив к антибиотику и лечение тетрациклином не даст антимикробного эффекта в отношении S. Aureus у данного больного даже при введении максимальных доз.

Серийные разведения в плотных средах чаще используют для одновременного тестирования большого количества штаммов (для посева можно использовать специальный штамп-репликатор). Учетным признаком в этом случае является наличие или отсутствие роста на поверхности агара.

Метод серийных разведений считается наиболее точным, но относительно трудоемким и дорогим.