Материально-техническое оснащение

1.Инструменты и оборудование: микроскоп, красители, медицинские лотки, бак. Петли, пробирки, пипетки, предметные стекла, культуры микроорганизмов, питательные среды.

2.Схемы и таблицы: «Микробиологическая диагностика дифтерии, микробиологическая диагностика туберкулеза».

Контрольные вопросы

1. Какие виды коринебактерий обитают в организме человека?

2. Дайте характеристику биологическим свойствам возбудителя дифтерии. Какой фактор патогенности определяет патогенез типичной дифтерии?

3. Как дифференцировать возбудителя дифтерии от непатогенных коринебактерий?

4. Какие бактерии вызывают туберкулез и микобактериозы человека?

5. Особенности иммунитета при туберкулезе. Что такое нестерильный иммунитет?

6. Дайте характеристику биологическим свойствам возбудителя туберкулеза.

7. С чем связана вирулентность и аллергические свойства микобактерий?

8. Как дифференцировать микобактерии туберкулеза от возбудителей микобактериозов?

9. Как и с какой целью проводят туберкулиновые пробы?

Выполнение лабораторной работы

1. Познакомиться (по демонстрационным таблицам) со схемами исследования при туберкулезе, дифтерии.

2. Познакомиться с методами отбора исследуемого материала при подозрении на туберкулез, дифтерийное носительство.

3. Изучить рост микобактерий на питательных средах.

4. Познакомиться с ускоренным бактериологическим методом исследования при туберкулезе.

5. Изучить демонстрационные микропрепараты из мокроты больного туберкулезом (окраска по Цилю-Нильсену), чистую культуру коринебактерий (окраска по Граму).

6. Изучить препараты, применяемые для диагностики, лечения и профилактики туберкулеза, дифтерии.

7. Решение ситуационных задач.

8. Оформить протокол.

Правила оформления протокола

1. Ответить на контрольные вопросы.

2. Зарисовать схемы исследования при туберкулезе, дифтерии.

3. Записать правила забора исследуемого материала на дифтерийное носительство.

4. Графически изобразить ускоренный бактериологический метод исследования при туберкулезе.

5. Отметить рост микобактерий на питательных средах.

6. Зарисовать демонстрационные микропрепараты из мокроты больного туберкулезом (окраска по Цилю-Нильсену), микроколонии патогенных микобактерий на стекле (окраска по Цилю-Нильсену), чистую культуру коринебактерий (окраска по Граму).

7. Дать характеристику иммунобиологическим препаратам, применяемым для специфического лечения и профилактики туберкулеза, дифтерии.

8. Дать интерпретацию результатам микробиологических исследований пациентов с туберкулезом и дифтерией.

Дополнительный материал

Микробиологическая диагностика возбудителя туберкулеза. Возбудителями туберкулеза у людей и животных являются Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis. Лабораторная диагностика туберкулеза включает обязательные методы (рекомендованные ВОЗ) — бактериоскопический и бак­териологический и дополнительные — биологический, серологи­ческий и аллергический. Материалом для исследования, исходя из патогенеза и клини­ческих проявлений, служат: мокрота, слизь с задней стенки глот­ки, гной, спинномозговая жидкость, кал, промывные воды же­лудка и бронхов, плевральный экссудат и др. Его собирают в сте­рильную посуду (мокроту — в специальные баночки, спинномоз­говую жидкость и другие материалы — в пробирки), которую эти­кетируют и направляют в специализированные лаборатории вме­сте с бланком, где указывают Ф.И.О. больного, группу диспан­серного учета, диагноз, цель исследования.

Микроскопия. Это исследование входит в обязательный поли­клинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. Положительный результат может быть по­лучен при концентрации микобактерий туберкулеза в материале не менее 10³ клеток/мл. Мокроту выливают в чашку Петри, ставят на черную поверх­ность стола, выбирают комочки гноя, наносят их на предметное стекло и растирают между двумя стеклами. Мазки высушивают в пламени и окрашивают по Цилю—Ниль­сену. Микобактерии туберкулеза, окрашенные в ярко-красный (ру­биновый) цвет, имеют вид тонких, длинных, слегка изогнутых или коротких прямых палочек; иногда в них обнаруживается зер­нистость. Микобактерии располагаются поодиночке или непра­вильными группами. Если микобактерий в материале мало и их не удается обнаружить в мазках обычным путем, применяют методы обогащения — гомогенизации и фло­тации.

Метод гомогенизации. Суточное количество мокроты выливают во флакон или банку, добавляют равный объем 1%-го водного раствора гидроксида натрия, плотно закрывают резиновой проб­кой и энергично встряхивают до полной гомогенизации (10 — 15 мин). Мокроту, утратившую вязкость, центрифугируют, надо­садочную жидкость сливают в дезинфицирующий раствор, оса­док нейтрализуют добавлением 2 — 3 капель 10%-й соляной или 30%-й уксусной кислоты. Из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю –Нильсену.

Метод флотации. Суточное (иногда 2-суточное) количество мок­роты гомогенизируют описанным выше способом. Для того, чтобы в материале не осталось слизистых комочков, флакон с гомогени­зированной мокротой помещают на 30 мин в водяную баню при +55 °С. Затем добавляют 1-2 мл ксилола (можно вместо ксилола добавить бензол, бензин, петролейный эфир и т.п.) и встряхива­ют в течение 10 мин, доводят дистиллированной водой уровень жидкости до горлышка флакона и дают ей 20-30 мин отстояться при комнатной температуре. Капельки ксилола с адсорбирован­ными микобактериями всплывают, образуя сливкообразный слой — флотационное кольцо. Материал из флотационного коль­ца берут петлей в форме улитки или пипеткой и наносят на пред­метное стекло, помещенное на подогретое до +55°С над водяной баней стекло. Высохший мазок покрывают новой порцией мате­риала до тех пор, пока на предметное стекло не будет перенесе­на большая часть флотационного слоя. Препарат промывают эфи­ром, высушивают, фиксируют и окрашивают по Цилю – Ниль­сену.

Для микроскопической диагностики туберкулеза широко при­меняют люминесцентную микроскопию. Фиксированный препа­рат окрашивают 15 мин. аурамин-родамином (при подогревании), затем обесцвечивают 3%-м солянокислым спиртом (погружением на 30 с), при необходимости для погашения фона докрашивают перманганатом калия (КМп0₄) или метиленовым синим, тща­тельно промывают и микроскопируют в ультрафиолете при уве­личении от 250х до 650х. Наблюдают ярко-желтое свечение мико­бактерий на темном фоне. При микроскопическом исследовании следует уделить особое внимание осмотру всей площади мазка. Чтобы с уверенностью судить о наличии или отсутствии микобактерий в препарате, сле­дует просмотреть не менее 100 полей зрения. Бактериоскопический метод позволяет лишь обнаружить кис­лотоустойчивые микобактерии, поэтому является ориентировоч­ным методом диагностики. Для точной дифференциации мико­бактерий необходимо применить бак­териологический метод.

Бактериологическое исследование. Выделение возбудителя яв­ляется более эффективным, чем бактериоскопия, и позволяет вы­явить 20 — 100 и более микобактерий в 1 мл исследуемого матери­ала, а также определить их устойчивость к лекарственным препа­ратам, вирулентность, типовую принадлежность и другие важные характеристики. Недостатком метода является длительность иссле­дования — 2—12 нед. В качестве плотных сред для выделения используют яичную среду Левенштейна-Йенсена, среду Финна II и другие. Колонии микобактерий туберку­леза непигментированные морщинистые, суховатые, с неровны­ми краями, возвышаются над поверхностью среды и напоминают бородавки. При отсутствии роста в течение 12 нед. Результат счи­тается отрицательным. Выросшие культуры микобактерий микроскопируют (после окраски мазков по Цилю-Нильсену) и проводят их идентифи­кацию по дифференцирующим признакам.

Ускоренный метод бактериологической диагностики туберкулеза (метод микрокультур Прайса). Мокроту, гной, осадок мочи или другой материал наносят толстым слоем на несколько стериль­ных узких (1 см) предметных стекол. Высушенный препарат берут стерильным пинцетом и погружают на 15 мин в 2%-ю серную кислоту, а затем — в стерильный раствор ИХН для промывания с целью удаления кислоты. После этого препараты помещают во флаконы с цитратной кровью, стараясь полностью погрузить ма­зок с материалом в среду. Технически данные методы выделения чистых культур трудо­емки и небезопасны. В настоящее время применяют полностью автоматизированные системы ВАСТЕС, в которых используются элективные среды и реагенты для флюоресцентного окрашива­ния микобактерий, что позволяет провести идентификацию мик­робов, а также определить чувствительность к антибиотикам в течение 3—15 дней (в среднем 4 — 6 дней). Методика полностью безопасна и позволяет одновременно производить культивирова­ние от 240 до 960 образцов.

Тема лабораторной работы: Возбудители дизентерии, кишечных эшерихиозов, холеры.

ЦЕЛИ: знать возбудителей холеры, кишечных эшерихиозов, дизентерии, их морфологические и физиологические особенности, факторы вирулентности, источники и механизмы заражения человека; методы микробиологической диагностики возбудителей дизентерии, кишечных эшерихиозов, холеры, средства и методы лечения и профилактики указанных инфекций; уметь обосновать выбор методов исследования, материала, особенностей его забора и доставки в лабораторию, интерпретировать результаты исследований.