Методы исследования физиологический функций и констант организма
(вопросы к экзаменам)
2014-2015 Кровь
Определение групп крови в системе АВО.
(а) Использование стандартных сывороток.
Стандартные сыворотки приготовлены из плазмы известной группы крови и содержат агглютинины соответствующей группы крови:
1 сыв – содержит альфа и бета-агглютиногены
2 сыв – содержит бета-агглютиноген
3 сыв – содержит альфа-агглютиноген
4 сыв – не содержит агглютиногенов (и используется для контроля).
(б) Использоание Цоликлонов.
Цоликлоны – растворы моноклональных антител к антигенам А. В и Д (резус), изготовленные с использованием методов генной инженерии. Для диагностики применяют Цоликлоны Анти-А, Анти-В ( и Анти-Д – для выявления резус-фактора). Например:
Лейкоцитарная формула здорового человека и метод ее определения.
Процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов в периферической крови. Определяют гистологическим методом: микроскопия сухого окрашенного мазка крови.
Подсчет форменных элементов крови.
(а) Подсчет эритроцитов.
Кровь разводят в 200 раз, используя 3% раствор NaCl. Подсчёт клеток проводят в камере Горяева, где объём разбавленной крови над одним маленьким квадратом составляет 1/20*1/20*1/10 = 1/4000 мм3 (или мкл).
При большом увеличении микроскопа считают количество клеток в 80 маленьких квадратах. В каждом квадрате считают клетки, находящиеся внутри квадрата, а также клетки, попавшие на верхнюю и левую его стороны.
Формула для расчета количества эритроцитов в 1 мкл:
Кол-во клеток в 80 мал кв.*200*4000/80
Нормальный показатель – 4-5 млн в мкл (или 4-5*1012 в литре)
(б) Подсчёт лейкоцитов.
Кровь разводят в 20 раз раствором уксусной кислоты (для гемолиза клеток) с добавлением метиленовой сини (для окрашивания ядер лейкоцитов). Подсчёт проводят под малым увеличением микроскопа в 25 больших квадрат, что составляет 400 малых квадратиков.
Формула для расчёта количества лейкоцитов в 1 мкл:
Кол-во клеток в 400 мал.кв.*20*4000/400
Нормальный показатель – 6-9 тыс в мкл (или 6-9*109 в литре)
Методы определения времени свёртывания крови и остановки кровотечения.
(а) Определение времени остановки кровотечения.
Этот показатель характеризует состояние первичного (сосудисто-тромбоцитарного) гемостаза. Используется видоизмененный метод Дюке: после неглубокого прокола пальца через каждые 20-30 сек промокают каплю выступившей крови с помощью фильтровальной бумаги до полной остановки кровотечения. Нормальный показатель – 1-3 минуты.
(б) Определение времени свёртывания крови.
Этот показатель характеризует состояние вторичного (коагуляционного) гемостаза. Используется метод Сухарева: в среднюю часть стеклянного капилляра помещают столбик крови и, периодически наклоняя капилляр, отмечают время до того момента, когда кровь перестанет перетекать по капилляру. Нормальный показатель – 5-10 минут (зависит от температуры воздуха в лаборатории).
Методы оценки внешнего (протромбиновое время) и внутреннего (АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время) путей коагуляционного гемостаза.
ПРОТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ (ПТВ)
Цитратную кровь центрифугируют. К образцу плазмы добавляют избыток кальция, чтобы восстановить её способность свёртываться. Добавляют тканевой фактор (ТФ III) и засекают время до образования сгустка.
В норме ПТВ = 11 – 16 сек.
ПРОТРОМБИНОВЫЙ ИНДЕКС (ПТИ)
рассчитывают как отношение ПТВ контрольной плазмы к ПТВ плазмы пациента. ПТИ выражают в процентах.
АКТИВИРОВАННОЕ ЧАСТИЧНОЕ ТРОМБОПЛАСТИНОВОЕ ВРЕМЯ
К цитратной плазме пациента добавляют не тканевой фактор, а каолин и фосфолипиды, чтобы активировать внутренний путь образования протромбиназы. Затем добавляют кальций и измеряют время до образования сгустка. В норме АЧТВ = 25 – 39 сек
Для нормального АЧТВ необходимы факторы I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII. Чтобы выяснить, какого ф-ра нет в плазме пациента, его плазму смешивают с разными плазмами, дефицитными по разным ф-рам свёртывания. Свёртывание не произойдёт только в том случае, если в диагностической плазме и плазме пациента отсутствует один и тот же фактор.
Оценка кислотно-щелочного состояния организма.
ОСНОВНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ КЩР
рН = 7.4 (отрицательный десятичный логарифм концентрации Н+)
РСО2 = 40 мм рт.ст. (парциальное давление СО2 в артериальной крови)
[HCO3-] = 24 ммоль/л (концентрация бикарбонатов в плазме крови)
Вместо [HCO3-] часто используют показатель «ВЕ» - избыток оснований (base excess): ВЕ = 0 норма (допустимые колебания + 2,5)
ВЕ > 0 избыток оснований
BE < 0 дефицит оснований
Показатели осмотического и онкотического давления крови. Значение.
Поскольку мембраны клеток проницаемы для воды и практически непроницаемы для солей, основным фактором, обеспечивающим переход воды через мембраны клеток, является осмотический градиент. В гипоосмотической среде клетки набухают (клеточный отёк), а в гиперосмотической среде клетки сморщиваются (обезвоживание клеток).
Показателем осмотического состояния внутренней среды является величина осмотического давления (в норме 7,2-7,6 атм), а также осмолярность – концентрация осмотически активных частиц в жидкостях организма (главным образом NaCl); в норме – 280-300 мосм/л. Способы измерения:
(а) осмометрия
Принцип работы осмометра: гидростатическое давление (рис. справа) уравновешивает движущую силу осмоса.
(б) Криоскопия.
Температура замерзания зависит от концентрации солей в растворе. Температура замерзания крови = – 0,56*С (что соответствует её нормальной осмолярности).
1/200 часть общего осмотического давления создают белки плазмы. Осмотическое давление, создаваемое белками, носит название онкотического давления (в норме 25-28 мм рт.ст.) Поскольку через стенку капилляров беспрепятственно проходит вода и все растворенные в плазме вещества кроме белков, онкотическое давление представляет собой силу, удерживающую воду в капилляре. В начале капилляра давление крови (35 мм рт.ст) выше онкотического давления – поэтому происходит фильтрация жидкости из капилляра в интерстиций. В конце капилляра давление крови (15 мм рт.ст)становится ниже онкотического давления – поэтому происходит реабсорбция жидкости из интерстиция в капилляр. Снижение онкотического давления (так же, как и повышение давления крови в капиллярах), приводит к развитию интерстициальных отёков. Причиной отёков может быть и нарушение лимфооттока (слоновость).
Определение осмотической резистентности эритроцитов.
Показатель осмотической резистентности характеризует прочность и эластичность клеточной мембраны эритроциов. Для исследования готовят рад пробирок с гипоосмотическими солевыми растворами от 0,7% до 0,22%, куда вносят дефибринированную кровь пациента. Через 20 минут растворы центрифугируют, чтобы оценить степень гемолиза. В норме гемолиз эритроцитов начинается в растворах с концентрацией 0,44% NaCl, а полный гемолиз отмечается в растворе 0,32 % NaCl. Осмотическая резистентность эритроцитов зависит от их возраста и формы, а также от состава плазмы.
Исследование буферных свойств сыворотки крови (опыт Фриденталя)
Сыворотка крови – это плазма, лишенная фибриногена. Она содержит те же буферные системы, что и плазма. Исследование заключается в том, чтобы выявить буферные свойства сыворотки и оценить её способность нейтрализовать кислоты и щелочи. Для этого в стаканчик с сывороткой и в стаканчик с таким же объёмом дистиллированной воды (для сравнения) добавляют раствор HCl до изменения цвета индикатора (метилоранж). Оказывается, к сыворотке нужно добавить в 300-400 раз больше кислоты, чем к дистиллированной воде. Затем другую пару растворов – сыворотку и дистиллированную воду – титруют щелочью до изменения цвета индикатора (фенолфталеин). Чтобы сделать реакцию раствора щелочной, к сыворотке нужно добавить щелочи в 50-70 раз больше, чем к воде. Сравнивают полученные результаты, чтобы убедиться, что буферная ёмкость сыворотки для нейтрализации кислот оказывается гораздо большей, чем для нейтрализации щелочей. Объясните, почему.
Значение минерального состава крови (Na, К, Са) на примере работы сердца.
Изолированное сердце лягушки перфузируют раствором Рингера (раствор содержит необходимое количество хлорида натрия, хлорида калия и хлорида кальция) и записывают кривую сокращений сердца. (а) Добавляют к раствору хлорид кальция и наблюдают сначала увеличение силы сокращений, затем неполное диастолическое расслабление и, наконец, остановку сердца в систоле. (б) Для создания дефицита ионов кальция к раствору Рингера добавляют щавелевокислый аммоний, который образует с кальцием нерастворимую соль Дефицит ионов кальция приводит к остановке сердца в диастоле. (в) Исследуют влияние на сердце избытка ионов калия. Добавление к раствору Рингера хлорида калия быстро вызывает остановку сердца в диастоле. Объясните, почему.
Гемолиз и его виды
Гемолизом называют разрушение клеток крови. В результате гемолиза эритроцитов гемоглобин выходит в раствор (плазму), кровь становится прозрачной, «лаковой». Различают несколько видов гемолиза:
(1) Осмотический гемолиз – происходит в гипотоническом растворе. Вода поступает в эритроциты, растягивает и, наконец, разрывает их оболочку.
(2) Механический гемолиз – разрушение клеток при встряхивании крови, во время работы искусственных клапанов сердца, аппарата искусственного кровообращения и пр. В организме механический гемолиз естественным образом происходит в пульпе селезёнки, где старые эритроциты с жёсткими, хрупкими клеточными мембранами протискиваются через узкие щели между трабекулами – и разрушаются. (3) Химический гемолиз – наступает в результате растворения белков или липидов клеточных мембран. Так действуют все жирорастворители (щёлочи, бензин, эфир, хлороформ). (4) биологический гемолиз – под действием гемолизинов растительного или животного происхождения (яды пчёл, змей, токсины микроорганизмов и др).