Методичні розробки лабораторних занять для студентів заочного відділення клітина - елементарна одиниця живого лабораторне заняття № 1

ТЕМА: Методи вивчення клітини.

І. МОТИВАЦІЯ ЦІЛІ: Цитологія є наукою, яка виникла як гілка мікроанатомії, проте останнім часом з чисто морфологічної дисципліни вона перетворилася у морфофункциональну. Одним з доказів тому є арсенал методів, які використовують для вивчення клітини.

ІІ. ЛІТЕРАТУРА ДЛЯ ПІДГОТОВКИ ДО ЗАНЯТТЯ:

ОБОВ'ЯЗКОВА

1. Лекційний матеріал.

2. Ченцов Ю.С. Общая цитология. – М.: Наука, 1978. – С. 9, 15-28

3. Заварзин А.А. Основы общей цитологии. – Л.: Изд-во ЛГУ, 1982

4. Сидорович М.М. Клетка – система систем разного уровня сложности. – Херсон, Айланнт, 2003. – С.7-8.

ДОДАТКОВА

1. Робертис Э.Д. Биология клетки. – М.: Мир, 1973. – С. 26-29, 94 – 134

2. Свэнсон К. Клетка. – М.: Мир, 1980. – С. 7-13.

3. Быков В.Л. Цитология и общая гистология (функциональная морфология клеток и тканей человека). – СПб.: СОТИС, 1998. – С.9-12.

ІІІ. ПИТАННЯ ДЛЯ САМОПІДГОТОВКИ І КОНТРОЛЮ

1. Назвіть відмінності методів світлової і електронної мікроскопій.

2. Вкажіть чесноти і недоліки методу скануючої електронної мікроскопії.

3. Назвіть особливості методу цитофотометрії.

4. Вкажіть особливості авторадіографічного методу дослідження.

5. Перерахуйте особливості методу культури тканини, вкажіть його чесноти і недоліки.

6. Назвіть область застосування методу мікрохірургії.

7. Вкажіть відмінності темнопольової мікроскопії від світлової.

8. Назвіть відмінності методу фазово-контрастної мікроскопії від світлової.

9. Вкажіть відмінність методу інтерференційної мікроскопії від фазово-контрастної.

10. Перерахуйте принципи гістохімії.

11. Назвіть основні етапи приготування постійних цитологічних препаратів.

12. Перерахуйте види гістологічних фарбників.

13. Вкажіть особливості методу диференціального центрифугування і область його застосування.

14. Перерахуйте види мікротомів.

15. Вкажіть особливості роботи на заморожуючому мікротомі.

16. Вкажіть відмінність методу люмінісцентної мікроскопії від світлової.

17. Перерахуйте біохімічні методи дослідження клітини.

1. Перерахуйте види тимчасових цитологічних препаратів, їх відмінності

від постійних.

ІV. САМОСТІЙНА РОБОТА НА ЗАНЯТТІ

ЗАВДАННЯ І. Ознайомитися з методикою приготування тимчасових цитологічних препаратів.

1. Приготування мазка крові.

Кожний студент виготовляє мазок за наступною методикою:

1. палець швидко проколоти пір'їнкою;

2. краплю крові нанести на край предметного скла (1);

3. краєм 2-го предметного скла (з шліфованим краєм) під кутом 45⁰ розтягнути краплю крові з одного кінця предметного скла (1) до іншого;

4. мазок зафіксувати в спирті або підсушити на повітрі;

5. пофарбувати мазок за методикою Романовського азур - ІІ + еозином протягом 5 хвилин (або гематоксилін + еозином);

6. промити мазок водою;

7. підсушити і розглянути під мікроскопом.

РЕЗУЛЬТАТ: Ядра - синьо-фіолетові, цитоплазма - рожева.

2.Виготовлення відбитка.

Кожний із студентів виготовляє відбиток за наступною методикою:

1. тварину (жабу) знерухоміти шляхом механічного руйнування спинного мозку;

2. витягнути необхідний орган (печінку, селезінку) в чашку Петрі;

3. промокнути орган фільтрувальним папером для видалення надлишку крові з його поверхні;

4. лезом на предметного склі відрізати від органу ділянку завтовшки 3-5 мм;

5. раневою поверхнею відрізаної ділянки органу 1-2 рази торкнутися до фільтрувального паперу, а потім 3-5 разів до чистого предметного скла;

6. відбиток зафіксувати в спирті;

7. відбиток підсушити на повітрі;

8. пофарбувати відбиток гематоксиліном - 3 хв..;

9. дофарбувати відбиток еозином - 1-3 хв.

РЕЗУЛЬТАТ: Ядра синьо-фіолетового кольору, цитоплазма - рожева.

ЗАВДАННЯ ІІ. Ознайомитися з роботою окуляр-мікрометра і з його допомогою виміряти клітини на препаратах № 1 Кров жаби. і №3 Яйцеклітина (жаби).

Вимірювання кліток проводити під малим збільшенням (починати з препарату №3 після пояснення викладачем послідовності роботи з обладнанням):

1. вибрати візуально середню по розмірах клітину;

2. визначити в ній величини великого і малого діаметрів (Малий діаметр повинен розташовуватися посередині великого і бути перпендикулярним йому);

3. Отримані дані підставити у формулу: S = , де

Д_б. - великий діаметр клітини;

Д_м. - малий діаметр клітини ;

π - 3,14

4. Визначити площу яйцеклітини на зрізі в умов. од. шкали окуляр - мікрометра.

5. Визначити площу еритроцита жаби на мазанні в умов. од. шкали окуляр - мікрометра.

6. Визначити у скільки разів за площиною клітини відрізняються одна від одної.

7. Користуючись даними п. п. 4 і 5 зробити висновок про розміри клітин різних тканин одного організму і пояснити їх різницю.

ДЕМОНСТРАЦІЙНА РОБОТА

ЗАВДАННЯ . Ознайомитися з особливостями методу приготування постійних цитологічних препаратів. Порівняти методики приготування тимчасових і постійних препаратів за тривалістю проведення і одержаними результатами.

І. СХЕМА ВИГОТОВЛЕННЯ ПОСТІЙНИХ ЦИТОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ

1. Взяття матеріалу: від органів беруть шматочок 5-10 мм товщиною;

2. Фіксація матеріалу: шматочки занурюють до фіксатору, для чого можуть бути використані розчин формаліну, 5-20 %, спирт, складні суміші Буену, Ценкера, Шабадашу і ін.

3. Ущільнення матеріалу:

а) найпростіший спосіб ущільнення - це заморожування зрізів;

б) складніший спосіб (для отримання більш тонких зрізів) - це заливка в парафін або целоїдин, розчин целлюлоїда в ацетоні або в спирт - ефірі. Перед заливкою проміжними етапами є обезводнення в спиртах висхідної міцності і витіснення спирту розчинниками для парафіну (ксилол, толуол або хлороформ) або целоїдину (ацетон або спирт з ефіром у відношенні 1:1).

4. Приготування зрізів. Товщина зрізів 5-30 мкм. Зрізи готуються за допомогою мікротому для парафінових зрізів.

Мікротом санний складається з таких частин:

• станина з рейками;

• держак для ножа (бритва);

• пристрій для підняття об'єкту на задану висоту;

• утримувач для об'єкту (шматочок тканини, прикріплений до дерев'яного блоку).

5. Забарвлення зрізів. Гістологічними барвниками селективно (вибірково) зафарблюють тільки ядра або цитоплазму або інші структури.

Класифікація гістологічних барвників:

А. Ядерні (основні барвники) забарвлюють ядра:

- гематоксилін - у фіолетовий колір;

- сафранін - у яскраво червоний ;

- кармін - в червоний.

Б. Цитоплазматичні барвники (кислі) забарвлюють цитоплазму:

- еозин - в рожевий колір;

- пікринова кислота - в жовтий;

- фуксин кислий - в червоний.

В. Спеціальні барвники:

- орсеїн - забарвлює еластичні елементи (волокна і мембрани) у вишнево-коричневий колір;

- судан І, II, III, IV - забарвлює жири в оранжевий або коричневий колір (судан чорний Б - в чорний) ;

- кармін за Бестом - забарвлює глікоген в червоний колір.

Г. Метод імпригнації - це осадження металевого срібла, золота, платини і їх солей. Використовується для виявлення нервової тканини і клітинних кордонів.

6. Заключення зрізів. Забарвлений зріз обезводнюють в серії спиртів, поміщають в ксилол, капають краплю канадського бальзаму і покривають покривним склом.

II. СХЕМА ВИГОТОВЛЕННЯ ТИПЧАСОВИХ ЦИТОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ

1. Ознайомитися з різними видами мікротомів (санний, швейний, заморожуючий) і особливостями роботи на них.

2. Ознайомитися з процесом наклеювання зрізів на скло і способами розпрямлення гістозрізів

3. Ознайомитися з методикою забарвлення зрізів:

а) распарафінування в ксилолі 3-5 хв.

б) провести крізь серію спиртових концентрацій, що знижуються, від 100⁰ до 70⁰ - по 2-3 мін. в кожному

в) дистилірована вода - 1-2 хв.

г) забарвлення гематоксиліном - 3-5 хв.

д) водопровідна вода - 10-15 хв..

е) забарвлення еозином - 4-5 хв.

ж) провести крізь серію спиртових концентрацій, що підвищуються від 80⁰ до 100⁰ - дуже швидко, бо можливе вимивання еозину.

з) просвітлення в ксилолі - 2-3 хв.

и) заключення в бальзам

Контроль засвоєння матеріалу проводиться наприкінці заняття при індивідуальній співбесіді з викладачем для з'ясовування вміння студента пов'язати теоретичний матеріал з виконаними зарисовками препаратів.

Вивчення теми завершується складанням колоквіуму „Методи вивчення клітини”, до якого входить розділ програми з цитології