ценцией, поскольку перед излучением фотонов молекула некоторое вре мя находится в триплетном состоянии.
Один из механизмов ее возбуждения можно представить следующим образом (см. рис. 11.57). Молекулы, находящиеся на нулевом колеба тельном уровне триплетного состояния Т\, за счет внутренней колеба тельной энергии, а также тепловой энергии (АЕ), сообщенной извне, пе реходят на более высокие колебательные уровни этого состояния, а затем вследствие интеркомбинационной конверсии — в первое возбужденное сииглетное состояние S\. Из возбужденного синглетного состояния S] молекулы возвращаются в основное состояние SQ, испуская фотоны. Про цессы, вызывающие появление замедленной флуоресценции £-типа, можно описать схемой:
7] + АЕ —> S|;
■S', —> S0 + hv.
Условия проявления замедленной флуоресценции довольно специ фичны. Этот тип молекулярной люминесценции наблюдается в весьма ограниченных диапазонах температур, вязкостей и концентраций раство ров. По сравнению с флуоресценцией и фосфоресценцией ее интенсив ность невелика и достигает максимальных значений при комнатной и бо лее высоких температурах, заметно ослабевая с понижением температуры.
Картина относительного расположения спектров поглощения, флуо ресценции, замедленной флуоресценции и фосфоресценции показана на рис. 11.58.
Способность веществ к люминесценции, как и к поглощению излу чения, связана с их электронным строением. Например, если низшее воз бужденное синглетное состояние органической молекулы обусловлено тс —> тс’ -переходом, то она часто имеет высокие выходы и флуоресцен ции, и фосфоресценции. В тех же случаях, когда низшее возбужденное синглетное состояние возникает в результате п -> п -перехода, то моле-i
кула обычно обладает малым, выходом флуоресценции, н» может обладать высоким вы ходом фосфоресценции при низкой температуре.
Важным фактором, обу словливающим флуоресцен
Рис. 11.58. Относительное расположение спек цию органических молекул, тров поглощения и люминесценции молекул: является также требование о
П — спектр поглощения; Фл — спектры флу наличии у них плоской, же оресценции (быстрой и замедленной); Фс — сткой структуры. Множество
спектр фосфоресценции молекул имеет неплоскую,
310
•So
Рис. 11.59. Относительное распо ложение синглетных (S0, Si), триплетных (Г|) и атомных электрон ных (А) уровней в хелатах металлов
нежесткую структуру. Отсутствие у них флуоресценции связывают с по терей энергии возбуждения за счет внутренней конверсии 51, —> So, вызы в а ю щ е й релаксацию энергии возбуждения путем вращения отдельных частей молекулы друг относительно друга. У плоских, жестких молекул вероятность безызлучательных процессов мала, а вероятность флуорес ценции, напротив, велика. Так, фенолфталеин и малахитовый зеленый не флуоресцируют, а флуоресцеин и родамин С, напротив, обладают интен сивной флуоресценцией.
фенолфталеин
Люминесценция комплексов металлов связана с природой и относи тельным расположением электронных уровней атома металла и органи ческого лиганда, а также переходами между ними. Если в комплексе уро вень атома металла А расположен выше синглетного S\ и триплетного Т\ уровней органического лиганда (рис. 11.59, а), то люминесцентные свой ства такого комплекса зависят от электронной структуры лиганда, а спек тры люминесценции определяются низшими возбужденными состояния ми лиганда, возникающими в резуль- — л
тате п -» п -перехода. Спектры таких комплексов представляют собой ши рокие размытые полосы. Подобные спектры наблюдаются обычно у ком плексов непереходных металлов с за полненными электронными оболоч ками.
Если в комплексах уровень атома металла А расположен ниже уровня St (рис. 11.59, б), то такие комплексы не
флуоресцируют в результате безызлучательных переходов 5, —> А и
S, —>7J. Однако при низкой температуре они могут обладать интенсив ной фосфоресценцией, которая является следствием повышенной интер комбинационной конверсии в триплетное состояние Т\.
В тех случаях, когда атомные уровни комплексов А располагаются ниже уровней лигандов Sx и Тх(рис. 11.59, в), то происходит интеркомби национная конверсия на уровень А. В этом случае может наблюдаться атомное испускание A —>S0. Это характерно для комплексов лантано
идов. Атомные уровни А в комплексах переходных металлов расположены довольно низко. Поскольку «/-электроны (в отличие от/-электронов) пло хо экранированы от внешних воздействий, возможно сильное тушение флуоресценции. Поэтому многие комплексы переходных металлов обла дают слабой флуоресценцией или не флуоресцируют вовсе.
Основные закономерности молекулярной люминесценции
Правило Каши касается формы спектров люминесценции (флуо ресценции, фосфоресценции) при возбуждении их излучением разных длин волн. Так как испускание квантов люминесценции всегда происхо дит с низшего электронно-возбужденного уровня молекулы, спектр лю минесценции будет всегда одним и тем же независимо от того, на какой энергетический уровень попал электрон в результате поглощения фотона. Это означает, что форма спектра люминесценции не зависит от длины волны возбуждающего излучения.
Закон Стокса—Ломмеля обусловливает взаимное расположение спектров люминесценции и поглощения и формулируется следующим образом: спектр люминесценции в целом и его максимум сдвинут по сравнению со спектром поглощения и его максимумом в длинноволно вую область. Это означает, что средняя энергия квантов люминесценции меньше средней энергии поглощенных квантов. Причина этого явления заключается в превращении части энергии поглощенных квантов в теп ловую энергию:
где hva — энергия поглощенного фотона возбуждающего света; hv, —
энергия фотона люминесценции; Q — энергия теплового движения молекулы.
Правило Левшина, называемое также правилом зеркальной сим метрии, утверждает, что нормированные спектры поглощения и флуо ресценции, представленные в виде графиков е = f( v ) и I / v = f(y ), зер кально симметричны относительно прямой, перпендикулярной оси час
312
тот и проходящей через точку пере сечения спектров v0 (рис. 11.60), при чем для v0 можно записать:
v„+vf =2Vo, |
(11.63) |
|
|
где va v iv f — симметричные частоты |
|
|
поглощения и флуоресценции. |
|
|
|
Частота |
vQ в выражении |
(11.63) |
|
|
может быть |
интерпретирована как |
|
|
частота чисто электронного перехода, |
|
|
т. е. перехода между нулевыми коле |
Рис. 11.60. Зеркальная |
симметрия |
бательными уровнями основного S0 и |
спектров поглощения е = f(v ) (!) и |
первого возбужденного Si синглет- |
флуоресценции I / v = f(v ) (1) рода |
ных состояний. Соотношение (11.63) |
является математическим выражени |
мина 6 Ж в ацетоне |
|
ем правила Левшина и легко преобразуется к виду: |
|
|
A v = va - v f |
= 2(va- v 0). |
(11.64) |
Если на оси абсцисс откладывать значения va, а на оси ординат — значе ния Av, то при зеркальной симметрии спектров поглощения и флуорес ценции должна получиться прямая с тангенсом угла наклона, равным 2 .
Зеркальная симметрия спектров поглощения и флуоресценции ха рактерна для сложных молекул и ие наблюдается в случае простых моле кул. Ее можно объяснить тем, что геометрия молекул мало меняется при электронном возбуждении, а расстояния между колебательными уровня ми и вероятности переходов на них у молекул в основном и электронно возбужденном состояниях близки.
Более строгое квантово-механическое обоснование правила Левшина дал Блохинцев. Он показал, что спектры поглощения и флуоресценции необходимо нормировать и строить в координатах e/v от v и I/v от v, соответственно.
Закон Вавилова устанавливает зависимость квантового выхода лю минесценции от длины волны возбуждающего излучения. Согласно это му закону фотолюминесценция может сохранять постоянный квантовый выход, если возбуждающая волна преобразуется, в среднем, в более длинную, чем она сама. Напротив, выход фотолюминесценции резко уменьшается при обратном превращении длинных волн в короткие. На рис. 11.61 представлена зависимость квантового выхода флуоресценции некоторых веществ от длины волны возбуждающего излучения.
Закон Вавилова уточняет закон Стокса—Ломмеля и предусматрива ет возможность возникновения люминесценции при возбуждении ее из лучением с большей длиной волны, чем излучение люминесценции (ан-
Ф а , о т н
Рис. 11.61. Зависимость относительного квантового выхода флуоресценции неко торых веществ от длины волны возбуждающего излучения:
I — родамин 6 Ж; 2 — урановое стекло; 3 — гидросульфат хинина; 4 — флуоресцеии
тистоксовая область возбуждения). Такая возможность реализуется вследствие того, что молекулы до поглощения квантов возбуждения могут обладать значительным запасом колебательной энергии, кото рая, суммируясь с энергией поглощенных квантов, может приводить к излучению квантов с большей энергией, чем энергия поглощенных
квантов: |
^ |
hv, = hva + Ey, |
(11.65) |
где hv, — энергия фотона люминесценции; hva — энергия поглощенного фотона; E v— энергия колебательного движения молекулы.
Закон затухания является одним из основных законов молекуляр ной люминесценции. Согласно этому закону интенсивность люминес ценции после прекращения возбуждения спадает со временем по экспо ненциальному закону:
I, = / 0 ехр(-//г), |
( 1 1 .6 6 ) |
где I, — интенсивность люминесценции в момент времени t\ / 0 — интен сивность люминесценции в момент прекращения возбуждения; т — дли тельность люминесценции (среднее время жизни возбужденного состоя ния). При t= г
/ т = / 0/е = /„/2 ,7 2 ~ 0 ,3 7 /0. |
(11.67) |
Таким образом, при экспоненциальном затухании люминесценции весь ход процесса свечения определяется величиной г.
314
И нт енсивност ь люминесценции и концент рация люминофора
Если интенсивность люминесценции характеризовать числом кван тов, испускаемых люминофором в единице объема в единицу времени, то, в соответствии с основным законом поглощения и определением квантового выхода люминесценции, зависимость интенсивности люми несценции от концентрации люминофора в растворе выражается фор мулой:
/ = Фж/ о( 1 - П = Ф ,/о (1 -1 0 -* ), ( . )
1 1 6 8
где /о — мощность возбуждающего излучения (число возбуждающих квантов, падающих на единицу объема раствора люминофора в единицу времени); Т — пропускание люминофора при длине волны возбуждаю щего излучения; к — коэффициент поглощения люминофора при длине возбуждающего излучения.
Если доля поглощенного люминофором возбуждающего излучения мала (klc < 0,05), формула (11.68) упрощается:
/ = 2,303ф ,/оЛ:/с. |
(11-69) |
Таким образом, интенсивность люминесценции пропорциональна квантовому выходу люминесценции, мощности возбуждающего излу чения, коэффициенту поглощения и концентрации люминофора. Фор мула (11.69) является математическим основанием количественного люминесцентного анализа. Зависимость интенсивности люминесцен ции от концентрации люминофора часто сохраняет линейный харак тер в пределах трех-четырех порядков величины концентрации. От клонения от линейности вызваны рядом причин: невыполнением со отношения klc < 0,05; явлением концентрационного тушения, ограни чивающим верхний диапазон линейности концентраций на уровне ~10“ 4 М, эффектом внутреннего фильтра и эффектом самопоглощения (реабсорбции).
Эффект внутреннего фильтра связан с поглощением части возбуж дающего излучения при прохождении через слой люминофора. Это вы зывает снижение интенсивности его люминесценции. Под самопоглощением понимают поглощение люминофором части люминесцентного из лучения. Это явление характерно для любых методов анализа, основан ных на испускании фотонов. С ним мы уже сталкивались при рассмотре нии атомно-эмиссионной спектроскопии (см. разд. 11.3.1). Самопогло щение минимально для слабопоглощающих растворов, а также если воз буждение люминесценции проводят при длине волны, соответствующей максимуму поглощения люминофора.
Тушение люминесценции
Выход люминесценции зависит от концентрации люминофора в рас творе, температуры, присутствия посторонних веществ. Уменьшение вы хода люминесценции под влиянием этих факторов называют тушением люминесценции.
Концентрационное тушение. В практике люминесцентного анализа прежде всего следует учитывать влияние концентрации люминофора, так как при больших концентрациях наблюдается эффект концентрационного тушения. Указанный эффект начинает проявляться с некоторой «порого вой» концентрации с0, при этом имеет место экспоненциальная зависи мость выхода люминесценции от концентрации:
Ф = Фо ехр[-&(с - с0)], |
(11.70) |
где фо — выход люминесценции при бесконечном разбавлении; & — константа.
Величина «пороговой» концентрации со и константа & специфичны для различных веществ. При с « с 0 ф = ф0 = const. Эффект концентра ционного тушения обратим: при разбавлении концентрированных рас творов выход люминесценции вновь достигает максимального значения, указывая на отсутствие сложных физико-химических превращений моле кул люминофоров.
Уменьшение выхода люминесценции с увеличением концентрации люминофора вызвано, с одной стороны, ассоциацией молекул люмино фора с образованием нелюминесцирующих агрегатов различного состава (механизм молекулярной ассоциации), а с другой — миграцией энергии от возбужденных молекул к невозбужденным (механизм миграции энергии).
Температурное тушение. Повышение температуры вызывает умень шение выходов флуоресценции и фосфоресценции. Это связано с тем, что безызлучательная дезактивация электронно-возбужденных состояний осуществляется преимущественно при соударениях излучающих моле кул, а частота таких соударений в растворах прямо пропорциональна температуре. Охлаждение, наоборот, увеличивает выходы флуоресцен ции и фосфоресценции. В области комнатных температур выход флуо ресценции обычно возрастает на несколько процентов при уменьшении температуры на 1 °С. Увеличение выхода флуоресценции по мере охлаж дения раствора наблюдается до того момента, когда температура и вяз кость раствора становятся благоприятными для испускания квантов фос форесценции. При дальнейшем охлаждении раствора выход флуоресцен ции остается постоянным, а выход фосфоресценции возрастает до тех пор, пока их сумма не приблизится к единице.
Тушение посторонними веществами. Выход люминесценции мо жет уменьшаться в присутствии посторонних веществ, называемых
тушителями. К наиболее активным туши телям люминесценции относятся: тяже лые анионы и катионы (Г, Br“, Cs+, Cu2+ и др.); парамагнитные ионы и молекулы (Мп2+, 0 2 и др.); молекулы растворителя. Взаимодействие тушителя с люминофо ром по своей природе может иметь либо химический (статическое тушение), либо физический (динамическое тушение) ха рактер.
Статическое тушение обусловлено образованием нелюминесцирующего продукта взаимодействия люминофора с тушителем. В качестве примера можно привести тушение флуоресценции 2 -(о-оксифенил)- бензоксазола ионами Си2+, вызванное образованием нефлуоресцирующе го бис-комплекса.
Частным случаем статического тушения является концентрационное тушение, связанное с образованием нелюминесцирующих димеров и бо лее крупных агрегатов молекул люминофора.
Динамическое тушение происходит, когда взаимодействие люмино фора и тушителя имеет физический характер, а тушение люминесценции осуществляется за счет передачи энергии от электронно-возбужденных молекул люминофора к частицам тушителя. Как для статического, так и для динамического тушения степень тушения люминесценции выражает ся уравнением Штерна—Фольмера:
где (р и (рQ — выходы люминесценции в отсутствие и в присутствии ту шителя; К — константа тушения; [Q] —концентрация тушителя.
В случае статического тушения константа К равна константе устой чивости Р нелюминесцирующего комплекса, а в случае динамического тушения она определяется константами скоростей различных процессов дезактивации электронно-возбужденного состояния молекул люминофо ра. Если в присутствии тушителя поглощение люминофора не изменяет ся, формулу (11.71) можно представить в виде
I / I e =l +K[Q], |
(11.72) |
где I и 1Q — интенсивности люминесценции в отсутствие и в присутствии тушителя.
Аппаратура и техника молекулярного люминесцентного анализа
Принципиальная схема прибора для люминесцентного анализа изо бражена на рис. 11.10. Отличительной особенностью люминесцентного
спектрометра является то, что в нем могут присутствовать два анализато ра частоты: входного (первичного), выделяющего излучение определен ного спектрального диапазона из потока света внешнего источника, и выходного (вторичного), выделяющего некоторый диапазон люминес центного излучения образца. Изменяя длину волны входного анализато ра, регистрируют спектры возбуждения люминесценции, а изменяя длину волны выходного анализатора — спектры люминесценции. Существуют и специальные методы анализа (синхронная и трехмерная люминесцент ная спектроскопия), основанные на одновременном изменении длин волн как возбуждающего, так и люминесцентного излучения.
Отметим, что, в отличие от спектрофотометрии, в люминесцентном анализе степень монохроматичности внешнего источника излучения не влияет на форму зависимости аналитического сигнала от концентрации. Поэтому входной анализатор частоты может и отсутствовать.
К источникам излучения в люминесцентном анализе предъявляются два основных требования. Во-первых, они должны давать излучение того спектрального диапазона, который поглощается образцом. Во-вторых, интенсивность этого излучения должна быть достаточно велика, по скольку величина аналитического сигнала — интенсивность люминес центного излучения / — прямо пропорциональна интенсивности источ ника излучения / 0 [см. формулу (11.69)]. Последнее обстоятельство со ставляет принципиальное отличие люминесцентных методов анализа от абсорбционных, для которых аналитический сигнал — оптическая плот ность — представляет собой относительную величину и не зависит от интенсивности источника излучения.
Как правило, люминофоры поглощают излучение в УФ или коротко волновой («синей») области видимого света. Поэтому в качестве источ ников излучения обычно применяют источники (непрерывного или ли нейчатого спектра), дающие интенсивное излучение в этих областях: вольфрамовые лампы накаливания, дуговые ксеноновые лампы, ртутные газоразрядные лампы. Анализаторы частоты используют те же, что и в спектрофотометрии: светофильтры, дифракционные решетки или (редко) призмы. Если не требуется изменение длины волны возбуждающего из лучения, то входным анализатором частоты обычно служит синий свето фильтр. Его роль состоит в отсечении длинноволновой (красной и ин фракрасной) части излучения источника, которая обычно не возбуждает люминесценцию, однако вызывает нагревание образца и, следовательно, снижение выхода люминесценции (температурное тушение).
Объектами люминесцентного анализа чаще всего служат растворы. Их помещают в кюветы, по конструкции аналогичные используемым в спектрофотометрии. Люминесцентное излучение обычно регистрируют под прямым углом к направлению излучения источника, чтобы исклю чить попадание последнего на детектор (фотоэлемент, фотодиод, ФЭУ).
С точки зрения общей методологии люминесцентный анализ весьма схож со спектрофотометрическим. Здесь также, как правило, проводят предварительную химическую реакцию определяемого вещества с целью селективного образования люминесцирующего (в спектрофотометрии — окрашенного) продукта. Очень часто применяемые для этого реагенты обладают собственной люминесценцией. Если спектры люминесценции реагента и продукта реакции различаются значительно, возможно прово дить определение без отделения избытка реагента. В противном случае такое отделение, как правило, необходимо. Существуют и косвенные ме тодики люминесцентного анализа, основанные на тушении люминесцен ции определяемым веществом (аналоги косвенных спектрофотометриче ских методик).
Количественный люминесцентный анализ базируется на зависимо сти между интенсивностью люминесценции и содержанием люминофора в образце. Условия его выполнения подбирают с таким расчетом, чтобы указанная зависимость была линейной [см. уравнение (11.69)]. Этого уда ется достигнуть лишь в том случае, если содержание определяемого ком понента в образце не превышает некоторого порогового значения; КГ4—? 10_ 3 М (для жидких образцов); КГ4 — 10” % (для твердых образцов).
Проведение количественного люминесцентного анализа осложняет ся тем, что интенсивность люминесценции зависит не только от содержа-, ния определяемого вещества в образце, но и от других факторов: туше ния люминесценции, эффекта внутреннего фильтра, pH среды, концен трации и др. В связи с этим следует строго соблюдать рекомендации, ка сающиеся подготовки образцов, а также условия возбуждения и регист рации спектров люминесценции.
По сравнению со спектрофотометрией люминесцентный метод имеет существенные преимущества. Прежде всего, чувствительность люминес центного метода гораздо выше фотометрического. Это связано с тем, что в люминесцентном методе определяют абсолютную величину потока излучения, испускаемого возбужденной молекулой, и, таким образом, отношение полезного сигнала к шуму очень велико. В противополож ность фотометрическому методу (где измеряется отношение двух пото ков излучения) в люминесцентном методе регистрируемая величина фо тотока, пропорциональная интенсивности люминенсценции, может быть многократно усилена электронным усилителем. Последнее обстоятельст во позволяет определять количества вещества на один-два порядка меньшие, чем в фотометрическом методе анализа.
Второе преимущество заключается в относительно высокой селек тивности люминесцентного метода анализа, поскольку сравнительно не большое число веществ способно люминесцировать.
Процедуру люминесцентного анализа многокомпонентных проб уда ется значительно упростить, применяя специальные методы — метод
