Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

Сходимость (повторяемость)

Сходимость (повторяемость) отклика выражается в виде рассчитанного

процентного относительного стандартного отклонения (RSD %) последовательных серий измерений с участием исследуемой пробы или раствора сравнения и

рассчитывается из выражения:

yi – индивидуальные значения площади пика, высоты пика или отношения площадей в методе внутреннего стандарта,

y – среднее индивидуальных значений,

n – число индивидуальных значений.

Максимальное допустимое относительное стандартное отклонение (RSDmax) рассчитывается для серии измерений с участием исследуемой пробы или раствора

сравнения для определённых пределов с использованием следующего выражения:

= KB n

RSDmax t90%,n−1

K – константа (0,349), полученная из выражения

K = 0,6 × t90%,5

2 6

в котором 0.26 соответствует требуемому RSD при 6 измерениях для B=1,0,

B – верхний предел, приведенный в определении в частной статье минус 100

процентов, предполагая, что верхний предел установлен согласно

воспроизводимости методики,

n– число повторных измерений для раствора сравнения (3 ≤ n ≤ 6),

t90%,n–1– коэффициент Стьюдента t для 90%-ной доверительной вероятности (двухсторонняя критическая область) с n - 1 степеней свободы.

ПРИГОДНОСТЬ СИСТЕМЫ

Тесты на определение пригодности системы являются неотъемлемой частью

методики и используются для того, чтобы удостовериться в адекватном функционировании хроматографической системы. Для оценки работы колонки

обычно используются следующие параметры: эффективность, концентрационный

коэффициент распределения, разрешение, относительное удерживание и фактор асимметрии.

На хроматографическое поведение могут влиять такие факторы, как состав,

ионная сила, температура и рН подвижной фазы, скорость потока, длина колонки, температура, давление, а также характеристики неподвижной фазы: пористость, размер частиц, удельная площадь поверхности, а в случае обращённой фазы –

степень химической модификации (блокирование концевых групп, число атомов

углерода и т.д.).

Различные компоненты используемого оборудования должны быть

проверены на соответствие их качества и должны обладать точностью измерений требуемой для проведения испытания или количественного определения.

Должны быть соблюдены следующие требования при отсутствии других указаний в частной статье.

-Величина фактора асимметрии основного пика должна находиться в пределах от 0,8 до 1,5, если только нет иных указаний в частной статье. Данное требование

распространяется как на тесты, так и на количественные определения, описанные в частных статьях.

-Максимальное допустимое относительное стандартное отклонение для повторных измерений для предписанного раствора сравнения не должно превышать величин,

приведенных в Таблице 2.2.46.-1. Данное требование распространяется только на количественное определение вещества и не используется в случае проведения

испытания на родственные соединения.

-Предел обнаружения пика (соответствующий отношению сигнал/шум равному 3)

находится ниже допустимого содержания примеси (порога, ниже которого присутствие примеси отрицается) в тесте на родственные соединения.

-Предел количественного определения пика (соответствующий отношению

сигнал/шум равному 10) равен или меньше, чем порог обнаружения примесей (порог, при котором отрицается присутствие примеси) в тесте на родственные

соединения.

Taблица 2.2.46.-1.

Требования к сходимости (повторяемости)

РЕГУЛИРОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ

В качестве информации ниже приведены интервалы, в пределах которых могут изменяться различные параметры хроматографических испытаний, без

принципиального изменения методики, для того, чтобы удовлетворять критериям пригодности системы. Описанные хроматографические условия были

валидированы в процессе подготовки этой статьи. Проверка пригодности системы включена для того, чтобы гарантировать требуемое разделение для удовлетворительного проведения теста или количественного определения.

Неподвижные фазы описаны только в общем виде, так как существует огромное количество их доступных коммерческих разновидностей, отличающихся по

хроматографическому поведению и для того, чтобы достигнуть предписанных требований пригодности системы, в ряде случаев приходится вносить некоторые изменения в хроматографические условия. В методиках обращено-фазовой

хроматографии, в особенности, регулирование различных параметров не всегда

приводит к удовлетворительному разделению. В этом случае может возникнуть необходимость заменить одну колонку другой, обеспечивающей желаемое

хроматографическое поведение, такого же типа (например, октадецилсиликагель), но от другого производителя.

Регулирование критических параметров для гарантии пригодности системы чётко указывается в частной статье.

Следует избегать множественных изменений условий, которые могут оказать совместное влияние на эффективность системы.

Тонкослойная и бумажная хроматография

Состав подвижной фазы: количество растворителя, содержание которого в смеси минимально, может изменяться в пределах ±30% (относительное

содержание) или ±2% (абсолютное содержание), в зависимости от того, что больше. Абсолютное содержание других компонентов не может быть изменено

более, чем на 10%.

pH водного компонента подвижной фазы: ± 0,2 pH, если только иное не

указано в частной статье, или ± 1,0 pH в случаях исследования нейтральных веществ.

Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: ±10%.

Наносимый объём: уменьшается на 20% от требуемого объёма при использовании пластинок с мелким размером частиц (2-10 мкм).

Расстояние перемещения фронта растворителя не должно быть меньше,

чем 50 мм.

Жидкостная хроматография

Состав подвижной фазы: количество растворителя, содержание которого в смеси минимально, может изменяться в пределах ±30% (относительное содержание) или ±2% (абсолютное содержание) в зависимости от компонента,

которого больше. Абсолютное содержание других компонентов не может быть

изменено более, чем на 10%.

pH водного компонента подвижной фазы: ±0,2 pH, при отсутствии других указаний в частной статье, или ±1,0 pH в случаях исследования нейтральных веществ.

Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: ±10%. Длина волны детектора: изменения не допускаются.

Неподвижная фаза:

-длина колонки: ± 70%,

-внутренний диаметр колонки: ± 25%,

-размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается.

Скорость потока: ± 50%.

Температура: ± 10%, максимум при 60°C.

Вводимый объём пробы: может быть уменьшен, при условии того, что

используемое детектирование и сходимость пика (пиков) остаются удовлетворительными.

Градиентное элюирование: конфигурация используемого оборудования может значительно изменить разрешение, время удерживания или относительные

удерживания, описанные в методике. Это может быть вызвано чрезмерной величиной объёма, между точкой встречи двух элюентов и входом в колонку.

Газовая хроматография

Неподвижная фаза:

-длина колонки: ±70%,

-внутренний диаметр колонки: ±50%,

-размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается,

-толщина плёнки : от - 50% до + 100%.

Скорость потока: ±50%. Температура: ±10%.

Вводимый объём пробы: может быть уменьшен, при условии того, что используемое детектирование и повторяемость остаются удовлетворительными.

Сверхкритическая флюидная хроматография

Состав подвижной фазы: для набивных колонок количество растворителя, содержание которого в смеси минимально, может изменяться в пределах ±30%

(относительное содержание) или ±2% (абсолютное содержание), в зависимости от

компонента, которого больше. Для капиллярной колонки изменения не допускаются. Длина волны детектора: изменения не допускаются.

Неподвижная фаза:

-длина колонки: ±70%,

-внутренний диаметр колонки: ±25% (набивные колонки), ±50% (капиллярные колонки),

-размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается (набивные колонки).

Скорость потока: ±50%. Температура: ±10%.

Вводимый объём пробы: может быть уменьшен, при условии того, что используемое детектирование и повторяемость остаются удовлетворительными.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Метод внешнего стандарта. Концентрация анализируемого компонента

(компонентов) определяется путём сравнения сигнала (сигналов) (пика (пиков)),

полученного для исследуемого раствора, и сигнала (сигналов) (пика(пиков)),

полученного для раствора сравнения.

Метод внутреннего стандарта. В исследуемый раствор и раствор

сравнения вводятся одинаковые количества компонента (внутреннего стандарта), который разделяется с исследуемым веществом и не взаимодействует с ним.

Концентрация исследуемого вещества определяется путём сравнения отношения площадей или высот пиков, соответствующих исследуемому веществу и внутреннему стандарту, для анализируемого раствора и отношения площадей или высот пиков, соответствующих исследуемому веществу и внутреннему стандарту,

для раствора сравнения.

Методика нормализации. Процентное содержание одного или большего

числа компонентов исследуемого вещества рассчитывается путём определения площади пика или пиков, как процентной части общей площади всех пиков,

исключая пики, соответствующие растворителям или любым добавленным реагентам и тем веществам, содержание которых ниже допустимого предельного

содержания.

Методика градуировки. Определяют связь между измеренным или рассчитанным сигналом (y) и количеством (концентрацией, массой и т.д.)

определяемого вещества (x) и рассчитывают уравнение градуировочной функции.

Аналитические результаты рассчитывают из измеренного или рассчитанного

сигнала с помощью обратной функции.

Для количественных определений основного вещества и компонентов в

частных статьях обычно используются методы внешнего и внутреннего стандартов

или методика градуировки; методика нормализации обычно не применяется. При проведении испытаний на родственные соединения обычно применяют метод внешнего стандарта с одним раствором сравнения либо методику нормализации. Вместе с тем, при использовании как методики нормализации, так и метода внутреннего стандарта, в случае если для сравнения используются разбавления исследуемого раствора, сигналы для родственных веществ должны быть близки к

сигналу самого вещества (фактор соответствия от 0,8 до 1,2), в противном

случае в тесте должны быть указаны величины поправочных факторов, обратных факторам соответствия.

Фактор соответствия представляет собой относительную величину, равную

соответствию равных масс родственных веществ при условиях, описанных в тесте.

Если испытание на родственные соединения предписывает определение общего содержания примесей либо подразумевает количественное определение

примеси, важно выбрать подходящую величину порога и подходящие условия сложения площадей пиков. В таких испытаниях допустимый предел, т.е. площади

пиков, которые лежат ниже предела и не принимаются во внимание, обычно равен 0,05%. Таким образом, пороговая величина в случае сложения величин

соответствует, по крайней мере, половине допустимого предела. Сложение площадей пиков примесей, которые не полностью разделяются с основным пиком,

лучше всего проводить экстраполяцией. Пики, соответствующие растворителям, используемым для растворения образца, также не принимаются во внимание.

2.2.47. КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

В общем, при рН более 3 капилляры с немодифицированной поверхностью, изготовленные из плавленого кварца, имеют отрицательный заряд, обусловленный

ионизацией силанольных групп, расположенных на внутренней стенке капилляра. Соответственно, электроосмотический поток направлен от анода к катоду. Если

необходимо получить хорошую воспроизводимость скорости миграции веществ, электроосмотический поток должен оставаться постоянным. В некоторых случаях требуется уменьшить или устранить электроосмотический поток путём

модификации внутренней стенки капилляра или изменения концентрации, состава и/или рН буферного раствора.

После введения исследуемой пробы в капилляр каждый ион аналита, входящего в состав пробы, мигрирует в среде фонового электролита согласно своей электрофоретической подвижности как независимая зона. Дисперсия зоны,

представляющая собой расширение полосы каждого вещества, является следствием различных явлений. При идеальных условиях вклад в процесс

расширения зоны вещества вносит только молекулярная диффузия вещества вдоль капилляра (продольная диффузия). В этом идеальном случае

эффективность зоны, выражаемая как число теоретических тарелок (n),

определяется как:

n = (μep ± μeo ) ×V ×l , 2 × D × L

где:

D – коэффициент молекулярной диффузии вещества в буферном растворе.

На практике значительный вклад в дисперсию полосы вносят процессы тепловой конвекции, адсорбции образца на стенках капилляра, а также неодинаковая проводимость между образцом и буферным раствором, длина

устройства для ввода пробы, размер ячейки детектора и расположение ёмкостей с

буферными растворами на разных уровнях.

Разделение двух полос (выражаемое как разрешение, Rs) может быть

достигнуто при изменении электрофоретической подвижности аналитов либо

электроосмотической подвижности, а также при увеличении эффективности полосы для каждого аналита, согласно уравнению:

АППАРАТУРА Прибор для капиллярного электрофореза состоит из:

-управляемого высоковольтного источника постоянного тока;

-двух резервуаров с буферными растворами, расположенных на одном и том же уровне и содержащих предписанные анодный и катодный растворы;

-двух электродов (катода и анода), погружённых в резервуары с буферными растворами и соединённых с источником тока;

-капилляра, в котором проводится разделение (обычно изготовленного из плавленого кварца); при использовании некоторых типов детекторов капилляр имеет оптическое окошко, расположенное на уровне детектора. Концы капилляра помещены в резервуары с буферными растворами. Капилляр заполнен раствором,

указанным в частной статье;

-подходящей системы ввода пробы;

-детектора, способного контролировать количество определяемых веществ, проходящих через разделяющий сегмент капилляра в течение определённого

времени; детекция обычно основана на абсорбционной спектрофотометрии (в УФ- и видимой областях) или флуориметрии, в ряде случаев может быть использовано

также кондуктометрическое, амперометрическое или масс-спектрометрическое детектирование; альтернативным способом детекции веществ, которые не

поглощают УФ-излучение и не флуоресцируют, является непрямое детектирование;

-для получения хорошо воспроизводимых результатов разделения рекомендуется

использовать термостат, способный поддерживать постоянную температуру внутри

капилляра;

-самописца и походящего интегратора или компьютера.

Описание процесса ввода пробы и его автоматизация являются

критическими факторами для точного количественного анализа. Ввод пробы может быть основан на использовании силы тяжести, давления, вакуума и электрокинетических сил. Количество каждого компонента образца, введённого электрокинетически, зависит от его электрокинетической подвижности, что приводит к возможным неравным условиям для разных веществ при использовании данного режима ввода пробы.

Используют капилляр, буферные растворы, способ пробоподготовки и

создания условий анализа, раствор пробы и условия миграции, указанные в частной статье для исследуемого вещества. Применяемый раствор электролита

фильтруют для удаления твёрдых частиц и дегазируют для предотвращения

образования пузырьков, мешающих работе детектора и созданию электрического контакта в капилляре во время процесса разделения. Для обеспечения воспроизводимых значений времени миграции веществ для каждой аналитической

методики должна быть разработана методика тщательной промывки системы.

КАПИЛЛЯРНЫЙ ЗОННЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПРИНЦИП

В капиллярном зонном электрофорезе аналиты разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор без антиконвективной среды. В данном методе разделение происходит вследствие того, что различные компоненты образца мигрируют с различной скоростью в виде отдельных полос. Скорость перемещения каждой полосы зависит от электрофоретической подвижности вещества и электроосмотического потока в капилляре (см. Общие принципы). Для

улучшения разделения веществ, адсорбирующихся на кварцевой поверхности,

могут быть использованы капилляры с модифицированной поверхностью.

При использовании данной разновидности капиллярного электрофореза

может быть осуществлён анализ как малых (Mr < 2000), так и больших молекул (2000 < Mr < 100 000). Благодаря высокой эффективности капиллярного

электрофореза в свободном растворе может быть проведено разделение молекул, имеющих очень незначительные различия в величинах отношений заряда к массе. При добавлении к разделяющему буферному раствору хиральных селекторов данный способ разделения позволят разделять хиральные соединения.

ОПТИМИЗАЦИЯ

Оптимизация разделения является комплексным процессом, в котором

основную роль могут играть несколько параметров разделения. Основными факторами, которые следует принимать во внимание при разработке методик

разделения, являются инструментальные параметры, а также параметры раствора электролита.

Инструментальные параметры

Напряжение. Время разделения обратно пропорционально приложенному

напряжению. Однако увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, повышение температуры и, как результат, образование

градиентов вязкости в буферном растворе, находящемся в капилляре. Данный

эффект приводит к расширению полосы и уменьшению разрешения.

Полярность. Полярность электродов может быть нормальной (анод на входе

и катод на выходе), электроосмотический поток при этом перемещается по

направлению к катоду. В случае обращённой полярности электродов электроосмотический поток направлен от выхода из капилляра и только заряженные аналиты с электрофоретическими подвижностями превышающими величину электрофоретического потока попадают к выходу.

Температура. Температура влияет, главным образом, на вязкость и электрическую проводимость и, как следствие, на скорость миграции. В некоторых

случаях увеличение температуры капилляра может вызвать конформационные

изменения в молекулах белков, что изменяет их времена миграции и эффективность разделения.

Капилляр. Размеры капилляра (длина и внутренний диаметр) влияют на

время анализа, эффективность разделения и загрузочную ёмкость. Увеличение как

эффективной, так и общей длины капилляра может ослабить электрическое поле (в

случае работы при постоянном напряжении), что приводит к увеличению времени

миграции. Для определённого буферного раствора и электрического поля тепловая конвекция и, следовательно, расширение полос образца зависит от величины

внутреннего диаметра капилляра. Последняя также влияет на предел обнаружения, зависящий от объёма введённой пробы и применяемого детектора.

Поскольку адсорбция компонентов образца на стенке капилляра влияет на эффективность, при разработке методики разделения должны быть предложены

способы предотвращения таких взаимодействий. В некоторых случаях, касающихся

белков, были предложены способы, позволяющие избежать адсорбции на стенке капилляра. Некоторые из таких способов (использование экстремальных рН и адсорбция положительно заряженных буферных добавок) для предотвращения адсорбции белков требуют лишь изменения состава буферной смеси. В других

способах внутренняя стенка капилляра покрывается полимером, ковалентно

связанным с поверхностью, что предотвращает взаимодействия между белками и

отрицательно заряженной поверхностью кварца. Для этих целей выпускаются готовые к использованию капилляры с покрытиями, состоящими из нейтральных

гидрофильных, катионных или анионных полимеров.

Параметры раствора электролита

Тип и концентрация буферного раствора. Буферные растворы, подходящие для капиллярного электрофореза, имеют соответствующую буферную ёмкость в выбранном диапазоне рН и низкую подвижность для уменьшения образования тока.

Подбор соответствующей подвижности буферного иона по отношению к

подвижности исследуемого вещества важен для уменьшения возможного изменения полосы. Тип растворителя, использованного для растворения

определяемого вещества, также важен для достижения фокусирования вещества на колонке, что увеличивает эффективность разделения и улучшает детекцию.

Увеличение концентрации буферного раствора (для данной величины pH) уменьшает электроосмотический поток и скорость вещества.

Величина рН буферного раствора. Величина рН буферного раствора может влиять на разделение вследствие изменения заряда аналита или добавок, а также

электроосмотического потока. При разделении белков и пептидов изменение рН буферного раствора от величины, превышающей изоэлектрическую точку (pI), до

величины, которая меньше её, изменяет суммарный отрицательный заряд

вещества на положительный. Увеличение рН буферного раствора обычно увеличивает электроосмотический поток.

Органические растворители. К водным буферным растворам для

увеличения растворимости веществ, а также (или) для изменения степени ионизации компонентов образца могут быть добавлены органические модификаторы (метанол, ацетонитрил и другие). Добавление таких органических модификаторов к буферному раствору обычно вызывает уменьшение электроосмотического потока.

Добавки для хиральных разделений. Для разделения оптических изомеров к

разделяющему буферному раствору добавляют хиральный селектор. Наиболее

часто используемыми хиральными селекторами являются циклодекстрины, в качестве таких веществ могут быть использованы краун-эфиры, полисахариды и

белки. Поскольку хиральное распознавание управляется различными

взаимодействиями между хиральным селектором и каждым из энантиомеров, разрешение, достигаемое для хиральных соединений, зависит, главным образом, от типа использованного хирального селектора. В этом отношении при разработке

методик определённых разделений может оказаться полезным использование циклодекстринов с различным размером полостей (α-, β- или γ-циклодекстрин) либо

модифицированных циклодекстринов с нейтральными (метил-, этил-, гидроксиалкил и другие) или способными к ионизации (аминометил-,

карбоксиметил-, сульфобутиловые эфиры и другие) группами. При использовании модифицированных циклодекстринов следует принимать во внимание различия в

степени замещения между разными партиями данных веществ, поскольку это может оказывать влияние на селективность. Другими факторами,

контролирующими разрешение при хиральных разделениях, являются концентрация хирального селектора, состав и рН буферного раствора, а также температура. Достигнутую величину разрешения также может изменять

использование органических добавок, таких как метанол или мочевина.