Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

меры для контроля за изменяемостью величин волновых чисел и интенсивности

сигнала прибора.

Подтверждение шкалы волновых чисел. Шкалу волновых чисел рамановских

сдвигов (обычно выражаемую в обратных сантиметрах) подтверждают с помощью подходящих стадартов, которые имеют характерные максимумы при исследуемых

величинах волновых чисел, например, органическое вещество, неоновая лампа или линии Ar+ плазмы из аргон-ионного лазера.

Градуировка прибора должна соответствовать типу образца, т.е. для твёрдых исследуемых образцов следует использовать твёрдые образцы сравнения, а для

жидких – жидкие. Выбирают подходящее вещество (например, инден, циклогексан или нафталин), для которого установлены точные значения сдвигов волновых

чисел. Образец индена, для предотвращения его разрушения, помещают в пробирку для ЯМР, вакуумируют и затем хранят в атмосфере инертного газа, в

прохладном и тёмном месте.

Таблица 2.2.48.-1

Сдвиги волновых чисел (и допустимые отклонения) для циклогексана, индена и

нафталина.

A Standard guide for Raman shift standards for spectrometer calibration (American Society for Testing and Materials ASTM E 1840).

B D. A. Carter, W. R. Thompson, C. E. Taylor and J. E. Pemberton, Applied Spectroscopy, 1995, 49 (11), 1561-1576.

Подтверждение шкалы интенсивностей. На абсолютную и относительную интенсивность рамановских полос могут оказывать влияние следующие факторы:

-состояние поляризации падающего света,

-состояние поляризации собирающей оптики,

-интенсивность падающего света,

-различия в отклике прибора,

-различия в фокусе и геометрии образца,

-различия в насыпной плотности для твёрдых образцов.

Подходящие критерии приемлемости могут изменяться в зависимости от применения, но в большинстве случаев допустимы колебания в относительных

интенсивностях полос ±10%.

Создание спектральных библиотек сравнения. Снимают спектры подходящего числа полностью исследованных (например, так как описано в монографии) материалов, которые имеют отличия в производителе, серии,

кристаллической модификации, размерах частиц и т.д., типичные для анализируемого материала. Набор спектров даёт информацию, которая определяет

границы подобия или количественного определения, которые могут быть использованы для того, чтобы, например, идентифицировать вещество или

проконтролировать его количество, образовавшееся в процессе производства. Число веществ в базе данных зависит от особенностей её применения. Коллекция

спектров в базе данных может быть представлена различными способами, определяемыми математической методикой, используемой для классификации или количественного определения.

Селективность базы данных, которая позволяет положительно

идентифицировать данный материал либо достоверно отличить его от других

материалов, содержащихся в базе данных, должна быть установлена во время процедуры валидации. Для уверенности в пригодности базы данных эта

селективность должна регулярно проверяться; в особенности это необходимо

делать после любых значительных изменений, произошедших с веществом (например, изменение поставщика или производственного процесса), либо при настройке прибора для рамановской спектрометрии (например, при подтверждении шкалы волновых чисел или воспроизводимости отклика спектрометра)

База данных пригодна только для исходного прибора, либо для подобного прибора при условии определения того, что перенесенная на прибор база данных

остаётся пригодной.

Метод. Подготовку и исследование образца проводят таким же образом, как и при создании базы данных. Для облегчения сравнения спектров и количественных

расчётов могут быть использованы подходящие математические преобразования

рамановских спектров.

Сравнение или преобразования спектров, количественный прогноз свойств

веществ, находящихся в исследуемом материале, могут проводиться с

использованием подходящих методов хемометрики, статистической классификации и градуировки.

2.2.54. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ, IEF) – это вариант электрофореза, в котором разделение белков происходит в соответствии с их изоэлектрическими точками. Разделение проводится на пластине из полиакриламида или агарозного геля, содержащего смесь амфотерных электролитов (амфолитов). При действии электрического поля амфолиты мигрируют в геле, создавая градиент рН. В некоторых случаях используют гели, имеющие фиксированный градиент рН, полученные путём включения слабых кислот или оснований в определённые места

геля во время его приготовления. Когда нанесённые белки достигают фракции геля,

которая имеет такое же значение рН, что и их изоэлектрическая точка (pI), заряд данных белков нейтрализуется и миграция прекращается. Градиенты могут быть

созданы в различных диапазонах рН в зависимости от выбранной смеси амфолитов.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

В изоэлектрической точке молекула белка незаряжена и не может передвигаться в матрице геля под действием электрического поля. Её перемещение, однако, может происходить в результате диффузии. Градиент рН

вынуждает белок оставаться в изоэлектрическом состоянии, концентрируя данное вещество. Такое концентрирование называется «фокусирование». Увеличение

приложенного напряжения или уменьшение количества нанесённого вещества улучшает разделение полос. Величина приложенного напряжения ограничена

выделяющейся теплотой, которая должна быть рассеяна. Использование тонких слоёв геля, а также пластин с эффективным охлаждением, контролируемых

термостатирующим устройством, предотвращает возгорание геля и в тоже время обеспечивает точное фокусирование. Разделение оценивают по минимальной разности pI (DpI), которая необходима для разделения двух соседних полос:

где:

D– коэффициент диффузии белка, dpHdx – градиент рН,

E– напряжённость электрического поля, в вольтах на сантиметр,

− dpHdμ – изменение подвижности вещества при изменение рН в диапазоне рН близком к pI.

Поскольку D и − dpHdμ для определённого белка не могут быть изменены, улучшить

разделение можно при использовании более узкого диапазона рН либо при

увеличении напряжённости электрического поля.

Разрешение между полосами белков в случае использования ИЭФ-геля, содержащего ведущие амфолиты, достаточно хорошее. Улучшить разрешение

можно при использовании фиксированных градиентов рН, для создания которых применяются буферные вещества, аналогичные ведущим электролитам,

сополимеризованные с матрицей геля. При использовании геля, содержащего ведущие электролиты, могут быть разделены белки, значения pI которых

отличаются на 0,02 единицы pH, в то время как фиксированные градиенты рН

позволяют разделить белки, изоэлектрические точки которых различаются

приблизительно на 0,001 pH. ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

Следует уделять особое внимание характеристикам и/или подготовке

образца. Наличие солей в образце может вызвать ряд проблем, поэтому лучше

всего при приготовлении образца использовать деионизированную воду или 2%-

ный раствор амфолитов, используя при необходимости диализ или гельфильтрацию.

Время, необходимое для завершения фокусирования в тонком слое полиакриламидных гелей, определяют путём нанесения окрашенного белка

(например, гемоглобина) в различные области поверхности геля и применения электрического поля: стабильное состояние достигается тогда, когда все нанесения дают идентичный образец полос.

В некоторых протоколах о завершении фокусирования судят по времени,

прошедшему после нанесения образца.

ИЭФ может быть использовано в качестве испытания на идентичность, В

этом случае исследуемый образец, мигрирующий на геле, сравнивается с подходящим стандартным образцом и ИЭФ-градуировочными белками. ИЭФ может

быть использовано в качестве испытания на предельное содержание. При этом плотность полосы на ИЭФ сравнивается соответственно с полосой на ИЭФ,

появляющейся при использовании стандартного образца. Если плотность измеряют с помощью денситометра или аналогичного устройства, позволяющего определить относительную концентрацию белка в полосе. ИЭФ может быть также использовано

при испытании на количественное содержание белков.

Прибор. Прибор для ИЭФ состоит из:

-управляемого генератора для создания постоянного потенциала, тока и мощности;

используются потенциалы величиной 2500 В, они считаются оптимальными для

используемых условий работы; рекомендуется источник тока, имеющий постоянную мощность до 30 Вт;

-жесткая пластиковая ИЭФ камера, в которой находится охлаждаемая пластинка или подходящий материал, служащий основой для нанесения геля;

-пластиковая крышка с платиновыми электродами, которые соединены с гелем с помощью бумажных фитилей подходящей ширины, длины и толщины, пропитанных

растворами анодных и катодных электролитов.

ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ В ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЯХ: ПОДРОБНАЯ МЕТОДИКА

Следующая методика представляет собой подробное описание процедуры

ИЭФ в пластинах полиакриламидного геля, используемой, если иное не указано в монографии.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕЛЕЙ

Матрица формования. Матрица формования (см. Рисунок 2.2.54.-1) состоит

из стеклянной пластинки (A,) на которую для облегчения работы с гелем помещена

полиэфирная плёнка (B), одной или нескольких распорных деталей (C), второй стеклянной пластинки (D) и зажимов, скрепляющих всю конструкцию.

Рисунок 2.2.54.-1 – Матрица формования

7,5%-ный полиакриламидный гель. Растворяют 29,1 г акриламида R и 0,9 г

метиленбисакриламида R в 100 мл воды R. К 2,5 объёмам этого раствора прибавляют смесь амфолитов, указанных в частной статье, и разбавляют до 10 мл водой R. Раствор аккуратно перемешивают и дегазируют.

Приготовление формы. Полиэфирную плёнку помещают на нижнюю стеклянную пластинку, вставляют распорную деталь, помещают вторую стеклянную пластинку и скрепляют конструкцию зажимами. Перед использованием раствор

помещают на магнитную мешалку и прибавляют к нему 0,25 объёма 100 г/л

раствора аммония персульфата R и 0,25 объёма тетраметилэтилендиамина R.

Немедленно заполняют раствором пространство между стеклянными пластинками формы.

Методика. Форму разбирают на составные части и, используя полиэфирную

плёнку, переносят гель на охлаждённую подложку, увлажнённую несколькими миллилитрами подходящей жидкости, избегая образования воздушных пузырьков. Готовят исследуемый раствор и растворы сравнения как указано в частной статье. Для нанесения образца помещают полоски бумаги размером приблизительно 10 мм × 5 мм на поверхность геля и пропитывают каждую предписанным количеством исследуемого раствора и раствора сравнения. Также наносят предписанное количество раствора белков с известными величинами изоэлектрических точек, служащих в качестве маркеров рН для градуировки геля. В некоторых протоколах вместо использования импрегнированных бумажных полосок используется гель,

который имеет желобки, предназначенные для помещения раствора образца. Отрезают 2 полоски бумаги длиной, соответствующей длине геля, и пропитывают

их растворами электролитов: кислотой для анода и щелочью для катода. Составы анодного и катодного растворов приводятся в монографиях. Эти бумажные

фитильки помещают на каждую сторону геля на расстоянии нескольких

миллиметров от его границы. Устанавливают крышку так, чтобы электроды пришли в контакт с полосками бумаги (соответственно анодным и катодным полями).

Выполняют изоэлектрическое фокусирование при использовании электрических

параметров, описанных в монографии. Когда миграция смеси стандартных белков

стабилизируется, электрический ток выключают. С помощью пинцета удаляют полоски, предназначенные для нанесения образца, и 2 электродных фитилька.

Погружают гель в фиксирующий раствор для изоэлектрического фокусирования в

полиакриламидном геле R. Выдерживают при аккуратном встряхивании при

комнатной температуре в течение 30 минут. Удаляют раствор высушиванием и

добавляют 200 мл обесцвечивающего раствора R. Выдерживают при перемешивании в течение 1 часа. Высушивают гель, добавляют кумасси

окрашивающий раствор R. Выдерживают в течение 30 минут. Обесцвечивают гель путём пассивной диффузии обесцвечивающего раствора R до тех пор, пока на

чистом фоне не станут хорошо видны полосы. Отмечают положение и интенсивность полос на электрофореграмме, как указано в монографии.

ИЗМЕНЕНИЯ ПОДРОБНОЙ МЕТОДИКИ (ПРЕДМЕТ ВАЛИДАЦИИ)

Там, где делается ссылка на общую методику изоэлектрического фокусирования, изменения в методологии или методике изоэлектрического

фокусирования могут быть предметом валидации. Они включают в себя:

-использование имеющихся в продаже гелей заводского производства, а также

окрашивающих и обесцвечивающих наборов,

-использование фиксированных градиентов рН,

-использование стержневых гелей,

-использование кассет геля различных размеров, включая ультратонкие (0,2 мм) гели,

-изменения в методике нанесения образца, включающие различные объёмы

образца или использование шаблонов или фитильков, изготовленных не из бумаги,

-использование альтернативных условий перемещения, включающих изменения электрического поля в зависимости от размеров геля и оборудования, а также

использование фиксированных времен миграции вместо субъективной

интерпретации стабильности полосы,

-включение стадии предварительного фокусирования,

-использование автоматизированного оборудования,

-использование гелей агарозы.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ

Если используются альтернативные способы по отношению к подробной

методике, они должны быть валидированы. Для валидации разделения могут быть

использованы следующие критерии:

-образование устойчивого градиента рН с желаемыми характеристиками, оцениваемого, например, с помощью окрашенных маркеров рН с известными величинами изоэлектрических точек,

-сравнение с электрофореграммами, полученными при использовании химического

образца сравнения для исследуемого образца,

-любые другие критерии валидации, указанные в монографии.

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ОБЩЕЙ МЕТОДИКИ

Изменения общей методики, необходимые при анализе некоторых веществ, могут быть подробно описаны в частных статьях. Они включают:

-добавление в гель мочевины (обычно 3 M концентрации достаточно для

поддерживания белка в растворённом состоянии, но может быть использована концентрация до 8 M): некоторые белки в изоэлектрической точке выпадают в

осадок, в этом случае для того, чтобы белок оставался в растворе в гель вводится мочевина; при использовании мочевины следует применять только свежие её

растворы, чтобы не допустить карбамоилирования белка;

-использование альтернативных способов окрашивания;

-использования добавок для геля, таких как неионные детергенты (например, октилглюкозид) или цвиттерионные детергенты (например, CHAPS или CHAPSO), и

добавление амфолита к образцу для предотвращения процессов агрегации и преципитации белков.

ПОЛОЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ СЛЕДУЕТ ПРИНИМАТЬ ВO ВНИМАНИЕ, ИСПОЛЬЗУЯ

ДАННЫЙ МЕТОД

Образцы могут наноситься на любой участок поверхности геля, но для того,

чтобы защитить белки от экстремальных величин рН, образцы не должны наносится в непосредственной близости от электродов. В ходе выполнения анализа

аналитик может нанести белок на гель в трёх местах (посередине и на обоих концах). Образцы белка, наносимые на противоположные концы геля, могут быть

различными.

Известно явление, называемое катодным дрейфом, при котором градиент рН с течением времени разрушается. Это может происходить, если фокусирование в

геле происходит слишком долго. Причины данного явления не совсем ясны, но

факторами, вызывающими катодный дрейф, могут быть электроэндоосмос и абсорбция диоксида углерода. Для исследования этой проблемы могут быть использованы фиксированные градиенты рН.

В течение фокусирования важно проводить эффективное охлаждение (приблизительно 4°C) ёмкости, в которую помещён гель. Высокие напряжённости электрического поля, используемые во время изоэлектрического фокусирования,

могут приводить к перегреванию и влиять на качество фокусируемого геля.

количеством кислоты серной концентрированной Р и 0,5 мл спирта Р;

образуется этилацетат, обнаруживаемый по запаху.

АЦЕТИЛ

Около 15 мг или указанное в частной статье количество испытуемоого образца

помещают в пробирку длинной около 180 мм и наружным диаметром 18 мм и

прибавляют 0,15 мл кислоты фосфорной Р. Пробирку закрывают пробкой, через

которую пропущена небольшая пробирка длинной около 100 мм и наружным

диаметром 10 мм, содержащая воду Р и выполняющая роль холодильника. На

внешнюю поверхность меньшей пробирки помещяют 1 каплю раствора лантана нитрата Р. Если субстанция относительно легко гидролизуется, устройство помещают на 5 мин в водяную баню, затем вынимают меньшую пробирку. Для

трудно гидролизуемых субстанций смесь медленно нагревают на открытом пламени до кипения. Каплю снимают, смешивают на фарфоровой пластинке с 0,05 мл 0,01 М

раствора йода. На край капли наносят 0,05 мл раствора аммиака разведённого Р2;

через 1-2 мин в месте соединения двух капель появляется синее окрашивание,

которое усиливается и сохраняется в течение короткого промежутка времени.

БАРБИТУРАТЫ (ЗА ИСКЛЮЧЕНИЕМ N-ЗАМЕЩЕННЫХ)

Около 5 мг испытуемого образца растворяют в 3 мл метанола Р, прибавляют 0,1 мл раствора, содержащего 100 г/л кобальта нитрата Р и 100

г/л кальция хлорида Р, перемешивают и прибавляют при встряхивании 0,1 мл

раствора натрия гидроксида разведенного Р, появляется фиолетово-синее

окрашивание и образуется осадок.

БЕНЗОАТЫ

а) К 1 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют 0,5 мл раствора железа (III) хлорида Р1; образуется розовато-желтый осадок, растворимый в эфире Р.

b) 0,2 г испытуемого образца, при необходимости измельченного, помещают в пробирку, смачивают 0,2 мл или 0,3 мл кислоты серной Р, осторожно нагревают дно пробирки; на внутренних стенках пробирки появляется белый налет.

с) 0,5 г испытуемого образца растворяют в 10 мл воды Р. К полученному раствору или к 10 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют 0,5 мл кислоты хлористоводородной Р; образуется осадок, который после

перекристаллизации из теплой воды Р и высушивания под вакуумом

(2.2.32) имеет температуру плавления (2.2.14) от 120°С до 124°С.

БРОМИДЫ

а) Навеску испытуемого образца, содержащую около 3 мг бромид-иона (Вг-), растворяют в 2 мл воды Р. Полученный раствор или 2 мл раствора,

указанного в частной статье, подкисляют кислотой азотной разведенной Р,

прибавляют 0,4 мл раствора серебра нитрата Р1, перемешивают и отстаивают; образуется светло-желтый творожистый осадок. Осадок отделяют центрифугированием и промывают тремя порциями воды Р по 1 мл каждая. Эти операции проводят быстро в защищенном от яркого света месте, при этом допускается, чтобы жидкость над осадком не была

полностью прозрачной. Полученный осадок суспендируют в 2 мл воды Р и прибавляют 1,5 мл раствора аммиака Р; осадок медленно растворяется.

b) Навеску испытуемого образца, эквивалентную около 5 мг бромид-иона (Вг-), или количество образца, указанное в частной статье, помещают в небольшую пробирку, прибавляют 0,25мл воды Р, около 75 мг свинца (IV)

оксида Р, 0,25 мл кислоты уксусной Р и осторожно встряхивают. Верхнюю

внутреннюю часть пробирки высушивают с помощью фильтровальной

бумаги и оставляют на 5 мин. Полоску фильтровальной бумаги необходимого размера пропитывают, помещая ее край в каплю раствора фуксина обесцвеченного Р и тотчас помещают пропитанную часть в пробирку. В течение 10 с у нижнего края фильтровальной бумаги появляется фиолетовое окрашивание, которое четко отличается от красной окраски фуксина,

наблюдаемой в верхней пропитанной части полоски бумаги.

c) # К 1 мл раствора, содержащего испытуемый образец в количестве, эквивалентном около 2-30 мг бромид-иона (Вг-), прибавляют 1 мл кислоты

хлористоводородной разведенной Р, 0,5 мл свежеприготовленного раствора

50 г/л хлорамина Р, 1 мл хлороформа Р и взбалтывают; хлороформный слой

приобретает желто-бурую окраску.

ВИСМУТ

а) 0,5 г испытуемого образца растворяют в 10 мл кислоты хлористоводородной

разведённой Р. Полученный раствор или 10 мл раствора, указанного в частной

статье, кипятят в течение 1 мин, охлаждают и при необходимости фильтруют. К 1 мл

полученного раствора прибавляют 20 мл воды Р; образуется белый или светло-

жёлтый осадок, цвет которого после прибавления от 0,05 мл до 0,1 мл раствора

натрия сульфида Р изменяется на коричневый.

b) Около 45 мг испытуемого образца растворяют в 10 мл кислоты азотной

разведенной Р. Полученный раствор или 10 мл раствора, указанного в частной

статье, кипятят в течение 1 мин, охлаждают и при необходимости фильтруют. К 5

мл полученного раствора прибавляют 2 мл раствора 100 г/л тиомочевины Р;

появляется желтовато-оранжевое окрашивание или образуется оранжевый

осадок. Затем прибавляют 4 мл раствора 25 г/л натрия фторида Р; раствор не

обесцвечивается в течение 30 мин.

с) # Навеску испытуемого образца, содержащую около 50 мг иона висмута,

взбалтывают с 5 мл кислоты серной разведенной Р и фильтруют. К

фильтрату прибавляют 2 капли раствора калия йодида Р1; образуется

черный осадок, растворимый в избытке реактива с образованием раствора

желтовато-оранжевого цвета.

ЖЕЛЕЗО а) Навеску испытуемого образца, содержащую около 10 мг железа-иона

(Fe2+), растворяют в 1 мл воды Р. К полученному раствору или к 1 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют 1 мл раствора калия феррицианида Р; образуется синий осадок, не растворяющийся при прибавлении кислоты хлористоводородной разведенной Р.

b) Навеску испытуемого образца, содержащую около 1 мг железа-иона (Fe3+), растворяют в 30 мл воды Р. К полученному раствору или к 3 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют 1 мл кислоты хлористоводородной разведенной Р и 1 мл раствора калия тиоционата Р;

появляется красное окрашивание. Отбирают две порции полученного раствора по 1 мл каждая. К одной порции прибавляют 5 мл спирта изоамилового Р или 5 мл эфира Р, встряхивают и оставляют до расслоения; органический слой

окрашивается в розовый цвет. К другой порции прибавляют 2 мл раствора ртути (II) хлорида Р; красное окрашивание раствора исчезает.

с) Навеску испытуемого образца, содержащую не менее 1 мг железа- иона (Fе3+), растворяют в 1 мл воды Р. К полученному раствору или к 1 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют 1 мл раствора калия ферроцианида Р; образуется синий осадок, не растворяющийся при прибавлении 5 мл кислоты хлористоводородной разведенной Р.

ЙОДИДЫ

а) Навеску испытуемого образца, содержащую около 4 мг йодид-иона (I-), растворяют в 2 мл воды Р. Полученный раствор или 2 мл раствора, указанного в частной статье, подкисляют кислотой азотной разведенной Р, прибавляют 0,4 мл раствора серебра нитрата Р1, перемешивают и отстаивают до образования светло-желтого творожистого осадка. Осадок отделяют центрифугированием и

промывают 3 порциями воды Р по 1 мл каждая. Эту операцию проводят быстро в защищенном от яркого света месте, при этом допускается, чтобы жидкость над осадком не была полностью прозрачной. Осадок суспендируют в 2 мл воды Р

иприбавляют 1,5 мл раствора аммиака Р; осадок не растворяется.

b)К 0,2 мл раствора испытуемого образца, содержащего около 5 мг йодид-иона (I-

) в 1 мл, или к 0,2 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют 0,5 мл

кислоты серной разведенной Р, 0,1 мл раствора калия дихромата Р, 2 мл воды Р,

2 мл хлороформа Р, встряхивают в течение нескольких секунд и оставляют до

расслоения; хлороформный слой приобретает фиолетовую или фиолетово- красную окраску.

с) # При нагревании 0,1 г испытуемого образца с 1 мл кислоты серной Р выделяются фиолетовые пары йода.