1.1. ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ (ОФС 42-0093-09)

Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы,

называется хроматографией на бумаге.

Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, пред-

варительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным, адсорбционным или ионообменным. Пере-

мещение подвижной фазы происходит либо только под действием капилляр-

ных сил (восходящая хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).

При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бу-

маге круглые или овальные пятна (зоны). Совокупность пятен, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хро-

матограммой.

Подвижность вещества при хроматографировании характеризуется ве-

личиной Rf, представляющей собой отношение расстояния от линии старта до центра пятна определяемого вещества к расстоянию от линии старта до линии фронта подвижной фазы (см. ОФС «Хроматография»).

Подлинность анализируемого вещества определяется при одновремен-

ном хроматографировании на одном листе бумаги анализируемого и стан-

дартного вещества. Если образцы идентичны, соответствующие им пятна на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения Rf. Для иденти-

фикации иногда целесообразно хроматографировать смесь равных количеств анализируемого и стандартного вещества. На хроматограмме должно набл ю-

даться одно пятно. Условия хроматографирования следует подбирать так,

чтобы значения Rf были отличны от 0 и 1.

При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество должны иметь разные значения Rf. При этом можно судить о степени чистоты анали-

зируемого вещества по величине и интенсивности окраски (или поглощения)

обнаруживаемых на хроматограмме пятен примесей. Содержание примесей может быть определено полуколичественно. Для этого на одном листе бума-

ги одновременно хроматографируют определенное количество анализируе-

мого вещества и несколько образцов определяемой примеси (свидетеля) c

различными, точно известными концентрациями. Содержание примеси в анализируемом образце оценивают, сравнивая ее пятно на хроматограмме по совокупности площади пятна и интенсивности окраски (или поглощения) с

пятнами свидетеля. При достаточном сходстве пятен примеси по форме и ок-

раске с пятнами основного вещества, взятого в том же количестве, допуска-

ется использование соответствующих количеств основного вещества в каче-

стве свидетеля.

Для количественного анализа применяют спектрофотометрические или видеоденситометры. Для обработки хроматограмм в видимой области спе к-

тра целесообразно использовать планшетные сканеры и соответствующее программное обеспечение.

Можно также провести количественное определение веществ после их экстракции с хроматограммы. Для этого пятна вырезают и экстрагируют оп-

ределяемое вещество. Содержание анализируемого вещества в извлечении или сухом остатке после отгонки растворителя находят любым методом,

пригодным для определения малых концентраций.

ОБОРУДОВАНИЕ

Для проведения хроматографии на бумаге используют герметизиро-

ванные камеры, изготовленные из инертного материала и позволяющие на-

блюдать за ходом процесса разделения при закрытой крышке камеры. Часто в качестве камер используют стеклянные стаканы или цилиндры с пришли-

фованной крышкой и дополнительно герметизированные. На крышке могут быть входные отверстия (шлюзы) для добавления растворителя или снятия избыточного давления в камере.

При проведении нисходящей хроматографии в верхней части камеры помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Лодочка должна вмещать объем подвижной фазы, достаточный для проведения, по крайней мере, од-

нократного хроматографирования. Длина лодочки должна превышать шири-

ну листа хроматографической бумаги. Камера должна быть снабжена уст-

ройствами для закрепления листа хроматографической бумаги в рабочем по-

ложении и для ввода в лодочку подвижной фазы.

При проведении восходящей хроматографии подвижную фазу поме-

щают либо в лодочку, установленную в нижней части камеры, либо налива-

ют на дно камеры.

Внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, что способствует более быстрому и полному ее насыщению парами растворите-

лей, входящих в состав подвижной фазы.

Подготовку оборудования, хроматографической бумаги и подвижной фазы приводят в частных фармакопейных статьях.

1.2. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ОФС 42-0094-09)

Хроматографический процесс в тонком слое сорбента, нанесенном на инертную твердую подложку (стеклянную, металлическую или полимер-

ную), называется тонкослойной хроматографией или хроматографией в тон-

ком слое сорбента (ТСХ).

Разделение может осуществляться по нескольким механизмам: адсорб-

ционному, распределительному, ион-парному, ионообменному, эксклюзион-

ному (гель-проникающему), хиральному или какой-либо их комбинации.

В результате движения анализируемого вещества и элюента под дейст-

вием капиллярных сил происходит разделение смеси исследуемых веществ на ее компоненты. При разделении вещества образуют на поверхности сор-

бента круглые или эллипсовидные пятна или полосы (хроматографические зоны).

Подвижность вещества при разделении характеризуется величиной Rf

и Rs (см. ОФС «Хроматография», уравнение 6 и рис. 1.4).

Параметры Rf и Rs используются для идентификации веществ и для оценки разделительной способности системы.

Испытание на подлинность (идентификация) анализируемых ве-

ществ проводится при одновременном хроматографировании одинакового количества анализируемого вещества и стандартного образца на одной и той же хроматограмме. При этом если вещества идентичны, то соответствующие им хроматографические зоны имеют одинаковую форму, интенсивность по-

глощения или окраски и равные величины Rf.

При испытаниях на чистоту основное вещество и примеси в условиях хроматографирования должны иметь разные значения Rf. При этом можно судить о степени чистоты анализируемого вещества по величине и интенсив-

ности пятен обнаруживаемых на хроматограмме примесей. Их содержание может быть определено полуколичественно. Для этого на пластинку наносят определенные количества анализируемого вещества и свидетелей. Для опре-

деления идентифицированных примесей в качестве свидетелей используют стандартные образцы идентифицированных примесей в количествах, соот-

ветствующих их предельному содержанию. Для определения неидентифици-

рованных примесей чаще всего используют растворы сравнения, приготов-

ленные путем разведения испытуемого раствора, как указано в частной фар-

макопейной статье. Содержание примеси в анализируемом веществе оцени-

вают, сравнивая зону примеси по совокупности величины и интенсивности с соответствующими пятнами свидетеля.

Количественное определение веществ на хроматограмме проводят,

как правило, денситометрически.

Основные приборы и материалы:

–пластинки с закрепленным слоем сорбента различных модификаций;

–хроматографические камеры;

–калиброванные капилляры и микрошприцы;

–устройства для нанесения на хроматограммы обнаруживающих реаген -

тов (пульверизаторы для опрыскивания, камеры для погружения хро-

матограмм в раствор и др.);

–вещества-стандарты, растворители, реагенты для обнаружения хрома-

тографических зон;

ультрахемископы с УФ-лампами на 254 нм и 365 нм.

Используемая лампа должна удовлетворять следующему тесту.

Проверка работы лампы. На пластинку силикагель G наносят 5 мкл

0,04 % раствора натрия салицилата в спирте 96 % для ламп с максимумом и з-

лучения при 254 нм или 5 мкл 0,2 % раствора натрия салицилата в спирте

96 % для ламп с максимумом излучения при 365 нм в виде пятна диаметром около 5 мм; пятно должно светиться.

При проведении анализов расстояние между лампой и хроматографи-

ческой пластинкой не должно превышать расстояния, используемого при проверке работы лампы.

Примечание. Используемый спирт должен быть свободен от флуоресцирующих веществ.

Хроматографические пластинки

Пластинка для ТСХ представляет собой твердую подложку (стеклян-

ную, металлическую или полимерную) с нанесенным слоем сорбента. Тол-

щина слоя сорбента от 0,1 до 0,25 мм для аналитического варианта и от 0,5

до 2,0 мм для препаративного.

Готовые хроматографические пластинки могут содержать флуоресци-

рующий индикатор для детектирования веществ, поглощающих в УФ-

области спектра при 254 и 365 нм.

Размер частиц сорбента для аналитического варианта ТСХ составляет

5–20 мкм. Наряду с такими пластинками можно использовать высокоэффек-

тивные хроматографические пластинки, содержащие сорбент с частицами размером 5–7 мкм. Такие пластинки позволяют увеличить эффективность разделения и уменьшить предел обнаружения хроматографических зон.

Выпускаются также пластинки с монолитными сорбентами и пластин-

ки с концентрирующей зоной (двухфазовые пластинки). Последние исполь-

зуются в фармацевтическом анализе для разделения сложных и гетерогенных смесей (экстракты из растительного лекарственного сырья, растворы табле-

ток со вспомогательными компонентами, мягкие лекарственные формы, сме-

си, содержащие пигменты, суспензии, растворы сухих экстракт ов и др.).

Хроматографические камеры

Используют хроматографические камеры для вертикального или гори-

зонтального элюирования с герметичными крышками. Камеры для горизон-

тального элюирования снабжены также устройствами для подачи элюента на пластинку. Перед проведением анализа обычно внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, смоченной подвижной фазой. Для вертикального элюирования применяют камеры с перегородкой в центре дна.

Использование камеры для горизонтального элюирования позволяет осуществлять одновременное элюирование с противоположных сторон пла-

стинки, что увеличивает производительность анализа в два раза по сравне-

нию с использованием камеры для вертикального элюирования. При этом также уменьшается расход подвижной фазы приблизительно в 10 раз. В го-

ризонтальной камере движение подвижной фазы по пластинке происходит только за счет капиллярных сил, вклад гравитации при этом отсутствует, что повышает эффективность разделения по сравнению с камерами для верти-

кального элюирования.

Подвижные фазы (ПФ)

Подвижные фазы (элюенты) должны быть предпочтительно малоток-

сичными, содержать минимум компонентов, не вступать в химические реак-

ции ни с сорбентом (НФ, неподвижной фазой), ни с компонентами разделяе-

мой смеси. ПФ должны также достаточно быстро испаряться с поверхности хроматограмм после элюирования.

Для подавления диссоциации полярных молекул компонентов разде-

ляемой смеси к ПФ добавляют вещества кислого или основного характера

(модификаторы).

Нанесение проб

Если это указано в частных фармакопейных статьях, пластинки предва-

рительно промывают растворителем и активируют нагреванием в течение 1 ч

при 100–105 С в сушильном шкафу. Перед нанесением проб пластинки должны храниться в герметично закрытом эксикаторе. Нанесение проб осу-

ществляют:

–калиброванными капиллярами с тупым концом;

–поршневыми микрошприцами с тупым концом иглы;

–полуавтоматическими или автоматическими аппликаторами.

Нанесение осуществляют двумя способами: в виде пятен (2–5 мм диа-

метром) с промежутками между пятнами не менее 10 мм и в виде полос дли-

ной от 10 до 20 мм с промежутком между ними не менее 10 мм. Расстояние линии старта от нижнего края пластинки должно составлять не менее 10 мм.

Во избежание «краевых эффектов» размывания фронта ПФ в процессе элюи-

рования перед нанесением проб соскабливают с обеих боковых сторон пла-

стинки слой сорбента шириной 2–3 мм. Расстояния на стартовой линии от боковых краев пластинки до мест нанесения первой и последней проб долж-

ны составлять не менее 10 мм. В процессе нанесения проб недопустимо по-

вреждение сорбента на линии старта. Подсушивание нанесенных проб осу-

ществляют в токе холодного или теплого воздуха, либо на специальном столе с электроподогревом.

Способы элюирования

Используют следующие способы элюирования: восходящее элюирова-

ние (одно- и многоступенчатое, одномерное и двумерное – с поворотом пла-

стинки на 90 или 180 ) и горизонтальное.

Восходящая хроматография

Если не указано иначе в частной фармакопейной статье, пластинку с нанесенными пробами помещают вертикально в камеру, предварительно на-

сыщенную парами ПФ в течение 1 ч при 20–25 С. Уровень ПФ должен быть расположен ниже линии старта. Камеру закрывают и проводят процесс при

20–25 С в защищенном от света месте. После прохождения фронта ПФ рас-

стояния, указанного в частной фармакопейной статье, пластинку вынимают из камеры, сушат и проявляют в предписанных условиях.

При проведении двумерной хроматографии пластинку высушивают после хроматографирования в первом направлении и хроматографируют в направлении, перпендикулярном первому.

Горизонтальная хроматография

Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру и направляют по-

ток ПФ из лотка в камеру согласно инструкции к прибору для горизонтального элюирования. Процесс проводят при 20–25 С (если это указано в частной фар-

макопейной статье, одновременно с противоположных сторон пластинки). Ко-

гда ПФ пройдет расстояние, указанное в частной фармакопейной статье, пла-

стинку вынимают, сушат и проявляют в предписанных условиях.

Двумерную хроматографию выполняют как указано в разделе «Восхо-

дящая хроматография».

Способы обнаружения

Обнаружение (детектирование) хроматографических зон после прове-

дения качественной и полуколичественной ТСХ осуществляют следующими способами:

–наблюдением под УФ-светом;

–опрыскиванием растворами обнаруживающих реагентов;

–выдерживанием в парах обнаруживающего реагента;

–погружением в растворы обнаруживающих реагентов в специальных камерах.

Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)

Эффективность разделения увеличивается как вследствие увеличения площади раздела подвижной и неподвижной фазы за счет уменьшения диа-

метра частиц сорбента, так и благодаря большей однородности размеров этих частиц. Применяют ВЭТСХ-пластинки, выполненные как в нормально-

фазовом (полярная НФ), так и в обращенно-фазовом (неполярная НФ) вари-

антах.

По сравнению с классической ТСХ использование высокоэффективных пластинок позволяет:

–увеличить число анализируемых проб за счет уменьшения диаметра стартовых пятен (до 1–2 мм) или длины полос (до 5–10 мм);

–уменьшить промежутки между стартовыми пятнами (до 5 мм);

–уменьшить время хроматографирования за счет уменьшения пробега фронта подвижной фазы (ПФ);

–уменьшить расход (объем) ПФ;

– снизить пределы обнаружения пятен и количественного определения определяемых веществ в 10–100 раз.

Применение ВЭТСХ обеспечивает получение более компактных пятен разделяемых соединений, что улучшает метрологические характеристики коли-

чественного определения с помощью сканирующей хроматоденситометрии.