3. СПЕКТРОМЕТРИЯ В БЛИЖНЕЙ ИНФРАКРАСНОЙ ОБЛАСТИ

(ОФС 42-0099-09)

Спектрометрия в ближней инфракрасной области (БИК спектрометрия,

англ. NIR) – метод, основанный на способности веществ поглощать электро-

магнитное излучение в диапазоне длин волн от 780 до 2500 нм (от 12500 до

4000 см-1).

Поглощение в БИК-диапазоне связано, как правило, с обертонами ос-

новных колебательных частот связей C-H, N-H, O-H и S-H и их комбинация-

ми. Наиболее информативным диапазоном является область от 1700 до 2500 нм

(от 6000 до 4000 см-1).

Анализ информации, извлекаемой из БИК-спектров, проводится с при-

менением хемометрических алгоритмов, которые требуют создания первич-

ного массива данных.

В рамках применимости метода, БИК-спектрометрия позволяет прямо или косвенно проводить качественную и количественную оценку химиче-

ских, физических и физико-химических характеристик анализируемого объ-

екта, в том числе оценивать следующие характеристики:

–содержание воды и органических растворителей;

–гидроксильное и йодное число, степень гидроксилирования;

–кристаллическую форму и степень кристалличности;

–полиморфную форму или псевдополиморфную форму;

–степень дисперсности частиц и другие.

БИК-спектрометрия обладает следующими возможностями:

–простота подготовки проб или отсутствие подготовки;

–быстрота измерений;

–неразрушающий характер анализа;

–возможность одновременной оценки нескольких параметров (показа-

телей);

– возможность проведения дистанционного контроля, в том числе в

технологических потоках в режиме реального времени.

Приборы. Используют как специализированные БИК-спектрофото-

метры, так и другие спектрофотометры, способные работать в ближней ИК-области спектра.

БИК-спектрофотометры состоят из:

– источника излучения, например, кварцевой лампы (лампы накалива-

ния) или ее аналога;

– монохроматора (дифракционная решетка, призма, оптико-

акустический фильтр) или интерферометра (спектрофотометры с Фурье-

преобразованием);

– регистрирующего устройства – детектора (на основе кремния, суль-

фида свинца, арсенида индия, арсенида индия -галлия, теллурида ртути-

кадмия, дейтерированного триглицина сульфата и др.);

– устройства размещения образца и/или дистанционного оптоволокон-

ного датчика.

Для размещения образцов используют стеклянные или кварцевые кю-

веты, флаконы, стеклянные стаканы, держатели капсул или таблеток и другие приспособления.

Спектрофотометры могут быть оснащены кюветным отделением, ин-

тегрирующей сферой (интегрирующая сфера представляет собой оптический компонент, состоящий из сферической полости с покрытием из хорошо от-

ражающего материала, сфера предназначена для получения спектров неодно-

родных образцов), внешними модулями для измерения пропускания сильно рассеивающих образцов, устройствами автоматической подачи образцов, оп-

товолоконными зондами. Выбор того или иного приспособления для анализа зависит от типа образца и выбранного способа измерения. Поэтому рекомен-

дованы к использованию приборы, реализующие несколько подходов к изме-

рению.

Обработка данных и анализ полученных результатов проводится с ис-

пользованием специального программного обеспечения.

Для каждого режима измерения (пропускание, диффузное отражение и их комбинация) должна быть предусмотрена своя методика поверки, вклю-

чающая проверку правильности установки длин волн и поверку фотометри-

ческого шума.

Проверка правильности установки длин волн. Для проверки правиль-

ности установки длин волн регистрируют спектр стандартного образца,

имеющего характеристические максимумы и минимумы поглощения и срав-

нивают полученные значения длин волн с заявленными характеристиками.

Для режимов пропускания и отражения для определения правильности установки длин волн наиболее распространено в качестве стандартных об-

разцов использовать оксиды редкоземельных элементов, пары воды в атмо-

сфере, метиленхлорид и другие.

В приборах с Фурье-преобразованием шкала волновых чисел линейна во всем рабочем диапазоне и для проверки точности установки достаточно использования одного стандартного образца с контролем заявленных харак-

теристик по одной полосе поглощения. Приборы других типов могут иметь нелинейный характер шкалы волновых чисел и требуют проверки заявлен-

ных метрологических характеристик не менее чем по трем пикам (один или несколько стандартных образцов) с охватом всего рабочего диапазона.

Погрешность при установке длин волн должна быть не более ±1 нм

(или эквивалентная ему величина волнового числа) в диапазоне длин волн до

1900 нм и не более ±1,5 нм для ди апазона длин волн ≥1900 нм.

Воспроизводимость установки длины волны должна соответствовать требованиям завода-изготовителя или требованиям нормативных докумен-

тов, действующих на территории Российской Федерации.

Проверка фотометрической линейности. Для проверки фотометриче-

ской линейности регистрируют БИК-спектры стандартных образцов с извест-

ными значениями пропускания/отражения и строят графическую зависи-

мость полученных значений пропускания/отражения от известных значений.

Результатом построения такой зависимости должна являться прямая линии с

Измерение пропускания. Пропускание является мерой снижения интен-

сивности излучения при прохождении через образец. Этот принцип реализо-

ван в большинстве используемых спектрофотометров, и результат может быть представлен непосредственно в единицах пропускания (T) и/или опти-

ческой плотности (A).

В качестве фона используют спектр воздуха или среды сравнения.

Способ применим для твердых и жидких проб, в том числе для дис-

персных систем.

Специальной подготовки проб при измерении пропускания, как правило,

не требуется. Для измерения спектра жидких образцов используют флаконы или кюветы с подходящей длиной оптического пути (обычно 0,5–22 мм), а так-

же оптоволоконные датчики на пропускание.

Диффузное отражение. В методе диффузного отражения измеряют ко-

эффициент отражения (R), представляющий отношение интенсивности света,

отраженного от образца (I), к интенсивности света, отраженного от фона (Ir):

R I ,

Ir

или обратную логарифмическую величину этого отношения (АR):

В качестве фона используют поверхность с высокой величиной R: пла-

стины из золота, перфторированных насыщенных полимеров, керамические пластины и другие подходящие материалы.

Способ используется для анализа твердых образцов с применением ин-

тегрирующей сферы или оптоволоконных датчиков, работающих в режиме отражения. В последнем случае, для воспроизводимости получаемых резуль-

татов, необходимо обеспечить стабильность условий проведения измерений,

в частности относительную неподвижность датчика, степень нажатия и дру-

гие условия.

Способ пропускания-отражения. Данный способ является комбинацией пропускания и отражения благодаря специальной конструкции кювет и датчи-

ков, в которых излучение дважды проходит через образец, что позволяет ана-

лизировать образцы с низкой поглощающей и рассеивающей способностью.

В качестве фотометрической величины используют коэффициент двойного пропускания (Т*):

T * I ,

IT

где: IT – интенсивность излучения после двойного пропускания, без образца;

I– интенсивность пропущенного и отраженного излучения, измеренная с образцом;

ивеличину, аналогичную оптической плотности (А*):

T *

В качестве фона используют спектр воздуха или среды сравнения.

Способ применим для жидких, в том числе негомогенных проб.

Для регистрации спектра исследуемый образец помещают в кювету с зеркалом или другим диффузным отражателем. Возможно использование оп-

товолоконного датчика, который погружают в образец.

Факторы, влияющие на результаты измерений

Температура образца. Температура образца может влиять как на его пропускание, так и на его отражение. Контроль температуры важен при ана-

лизе термически лабильных объектов, в случае которых разница в несколько градусов может приводить к существенным спектральным изменениям: твер-

дые образцы, содержащие воду, дисперсные системы, аморфные объекты и прочее.

Влага и остаточные количества растворителей. Наличие воды и оста-

точных количеств растворителей может оказать влияние на характер спектра

и результаты анализа. Необходимость и условия высушивания должны быть указаны в частных фармакопейных статьях.

Толщина образца определяет степень пропускания. С увеличением толщины слоя наблюдается увеличение поглощения. Поэтому при сравни-

тельных измерениях пропускания толщина образца должна быть одинаковой или учитываться. При измерении отражения толщина слоя не имеет принци-

пиального значения, но нужно учитывать, что толщина слоя должна быть со-

поставимой с глубиной проникновения луча в образец. В случае недостаточ-

ной толщины, за образцом ставится дополнительный рефлектирующий мате-

риал, например штамп с золотым покрытием.

Оптические свойства образца. При анализе твердых образцов необхо-

димо обеспечивать максимально возможную однородность пробы, так как различия в плотности или размерах частиц сказываются на характере спек-

тра. Спектры физически, химически или оптически гетерогенных образцов следует регистрировать либо с увеличенным размером пучка света, либо ис-

пользуя устройства, вращающие образцы во время измерений. При этом же-

лательно проводить измерения каждого образца несколько раз с последую-

щим усреднением спектров.

Полиморфизм. Разница в кристаллической структуре (полиморфизм)

оказывают влияние на спектр, что позволяет отличать друг от друга кристал-

лические или аморфные формы на основании их БИК-спектра. При проведе-

нии анализа необходимо учитывать, эталонный спектр, какой кристалличе-

ской структуры (модификации) используется в методе анализа.

Возраст образцов. Свойства образцов могут изменяться во времени, и

эти изменения могут обуславливать спектральные различия для одних и тех же образцов. Данные изменения должны быть учтены при построении калиб-

ровочных моделей, как для целей идентификации, так и для целей количест-

венного анализа.

Идентификация

Идентификация в БИК-спектрометрии основана на принципе идентич-

ности спектров одного и того же вещества.

Для проведения идентификации первоначально создают библиотеку эталонных спектров (далее по тексту «библиотека»), подбирают оптималь-

ную математическую модель для обработки спектров и реализации алгорит-

мов их сравнения, то есть создают метод идентификации. Далее проводят ва-

лидацию библиотеки в совокупности с выбранной математической моделью

(см. раздел «Валидация метода идентификации»). Идентификацию проводят путем сравнения спектра испытуемого образца со спектрами в библиотеке

(см. раздел «Анализ данных»).

Создание библиотеки спектров. Библиотека содержит совокупности спектров, несущие характеристическую информацию о каждом объекте ана-

лиза. Для каждой совокупности спектров при помощи соответствующих ме-

тодов и алгоритмов определяют оптимальные параметры идентификации.

Данные установки действительны для всей библиотеки. Для близких объек-

тов, неразличимых при заданных установках, создаются подбиблиотеки, в

которых могут быть использованы другие методы предварительной обработ-

ки спектров и алгоритмы анализа. Количество спектров в библиотеке не ог-

раничивается, но при большом их количестве идентификация химически сходных веществ затрудняется.

В библиотеку включают спектры веществ, соответствующих предъяв-

ляемым требованиям, подлинность которых подтверждена иными фармако-

пейными методами.

Для учета возможных вариаций свойств каждого вида анализируемых объектов регистрируют спектры нескольких партий (серий). Регистрацию спектров проводят при соблюдении схожести условий измерений и первич-

ной обработки, которые предварительно оптимизированы для всех анализи-

руемых объектов и сохраняются постоянными при последующих измерени-

ях. В библиотеку не включают спектры, являющиеся случайными выбросами.

Методы предварительной обработки спектров. Рекомендуется пред-

варительная обработка спектров с целью повышения информативности полу-

чаемых результатов и уменьшения влияния спектральных вариаций. Обра-

ботка первичных данных может включать вычисление первой или второй производной, векторную нормализацию, мультипликативную коррекцию рассеивания и другие методы, включая комбинированные. Следует учиты-

вать, что математическая обработка может привести к потере информации или появлению ошибок-артефактов.

Выбор математической модели и алгоритмов должен быть обоснован.

Анализ данных. Сравнение спектров испытуемых образцов при иден-

тификации проводится с индивидуальными или усредненными спектрами в библиотеке, например, путем корреляционного анализа. Метод идентифика-

ции должен быть валидирован.

Валидация метода идентификации. Валидация метода идентификации призвана продемонстрировать его пригодность для предусмотренного анали-

за. Валидация метода предполагает проверку показателей спец ифичности и устойчивости.

Специфичность показывает, что каждый объект, спектр которого со-

держится в библиотеке, будет положительно идентифицирован и будет отли-

чаться от других объектов, при этом объекты, не включенные в библиотеку,

идентифицируются отрицательно.

Устойчивость показывает, что незначительные изменения условий (на-

пример, температура, влажность воздуха, вибрации, температура образца,

степень уплотнения материала, глубина погружения зонда, толщина слоя и т. д.) не влияют на результаты и надежность идентификации.

Количественный анализ

Разработка методики (калибровка). При разработке методики для ко-

личественного анализа (калибровки), изменения интенсивности поглощения или отражения в спектре коррелируются с изменениями свойств и/или соста-

ва веществ. При этом регистрируют спектры образцов с известными значе-

ниями их химического состава и/или их свойств, подтвержденными иными фармакопейными методами. Так как хемометрические алгоритмы не допус-

кают экстраполяций, необходимо, чтобы область калибровочных концентра-

ций была больше, чем ожидаемый диапазон анализируемых концентраций или свойств. Калибровочные образцы, по возможности, должны быть равно-

мерно распределены внутри диапазона рабочих концентраций.

Регистрацию спектров проводят при соблюдении параметров экспери-

мента, факторов, влияющих на результаты измерений и первичной обработ-

ки, которые предварительно оптимизированы для всех анализируемых объ-

ектов и сохраняются постоянными при последующих измерениях. В библио-

теку не включают спектры, являющиеся случайными выбросами.

Калибровочную модель оптимизируют при помощи подходящего спо-

соба предварительной обработки спектров, выбора спектральной области и математического алгоритма.

Методы предварительной обработки спектров. Проводят так же, как описано в разделе «Идентификация».

Выбор математической модели и алгоритмов должен быть обоснован.

Анализ данных. Для калибровки может использоваться любой обосно-

ванный математический алгоритм. Так как в области ближнего ИК-диапазона наблюдается сильное перекрывание полос поглощения, количественный ана-

лиз проводят с реализацией преимущественно хемометрических алгоритмов,

например таких, как метод частных наименьших квадратов (МЧНК, англ. PLS), метода регрессии на главные компоненты (МРГК, англ. PCR) и других.

Валидация калибровочной модели. Валидация модели калибровки пред-

полагает демонстрацию ее пригодности для решения поставленной задачи.

При этом должны быть оценены такие показатели, как специфичность (се-

лективность), линейность, рабочий диапазон концентраций (аналитическая область), правильность, прецизионность и устойчивость.

Для демонстрации специфичности существуют следующие подходы:

–выбранный спектральный диапазон или полоса поглощения связана с анализируемым свойством объекта (например, концентрация, содержание влаги и т. д.) и коррелирует с фотометрической величиной;

–демонстрируется, что изменения в составе плацебо в пределах рабо-

чего диапазона концентраций не оказывают существенного влияния на ре-

зультаты количественного измерения определяемого образца;

– допускаются другие обоснованные подходы.

При валидации линейности должно быть показано, что результаты, по-

лученные методом БИК с реализацией выбранного алгоритма обработки, с о-

поставимы с результатами, полученными другим стандартным методом. В

качестве критерия приемлемости может быть выбран коэффициент детерми-

нации (r2), коэффициент корреляции (r) или иной критерий, определяющий пригодность калибровочного метода.

Диапазон рабочих концентраций определяет интервал, в котором со-

блюдаются заявленные валидационные показатели. Результаты испытаний,

выходящие за пределы данного диапазона, являются неприемлемыми.

Правильность методики должна доказывать отсутствие значимой систе-

матической погрешности или обоснованность поправочных коэффициентов,

вводимых в расчеты при ее наличии. Правильность оценивается путем со-

поставления результатов, полученных с использованием модели калибровки и результатов, полученных стандартным методом.

Прецизионность описывает степень рассеивания результатов анализа.

При этом должна быть оценена как внутрилабораторная, так и межлабора-

торная прецизионность.

Устойчивость методики количественного анализа показывает, что не-

значительные изменения условий не влияют на результаты количественного определения.

Выбросы. При анализе методом БИК следует учитывать, корректиро-

вать или обоснованно исключать резко выделяющиеся результаты как внутри рабочего диапазона, так и вне данного диапазона.

Выбросы, находящиеся в пределах рабочего диапазона , подлежат даль-

нейшему исследованию и, в случае их информативной важности, могут быть включены в модель.

Выбросы, находящиеся вне калибровочного диапазона , также подлежат анализу. Если полученные результаты подтверждены стандартным методом,

спектры таких проб могут быть внесены в калибровочную модель с после-

дующей ревалидацией метода.

Ревалидация. Прошедший валидацию и признанный пригодным для применения БИК-метод идентификации или количественного анализа нуж-

дается в последующей периодической валидации (ревалидации). При уста-

новлении отклонений необходима корректировка метода. Необходимость ре-

валидации зависит от характера изменений.

БИК-метод нуждается в ревалидации, если:

–в библиотеку добавляется новый объект (для качестве нного анализа);

–есть предпосылки к изменению характеристик объектов, спектры ко-

торых уже включены в библиотеку (изменение технологии производства

(синтеза), состава, качества исходного сырья упаковки и т. д.);

– обнаружены иные изменения и/или несоответствия в свойствах ана-

лизируемых объектов или методике.

Перенос методик. При переносе методик идентификации и количест-

венного анализа с одного прибора на другой должны учитываться спектраль-

ные характеристики используемых спектрофотометров (разрешение, диапа-

зон волновых чисел и др.). Спектрофотометры с высокой фотометрической точностью и точностью по волновому числу (например, Фурье-

спектрофотометры), позволяют осуществить прямой перенос методов как ка-

чественного, так и количественного анализа без дополнительных манипуля-

ций. Если прямой перенос невозможен, применимы различные математиче-

ские способы для переноса моделей.

После перенесения методов необходима их ревалидация.

Хранение данных. Хранение данных осуществляется в электронном виде в соответствии с требованиями программного обеспечения. При этом необходимо сохранять исходные спектры, не подвергшиеся математической обработке, с целью их возможного дальнейшего использования при оптими-

зации библиотек или методов.