Биохимия растений

мРНК. При использовании в качестве матрицы химически моди˝- фицированных молекул РНК с помощью фермента обратной транскриптазы возможен также синтез искусственных гено˝в.

12.7. СИНТЕЗ НУКЛЕОТИДОВ

Для синтеза нуклеиновых кислот, коферментных нуклеотид-

ных группировок ферментов, макроэргических нуклеозидпо˝лифосфатов необходимы пуриновые и пиримидиновые нуклеоти˝ды.

Продуктами их первичного синтеза являются соответствую˝щие

рибонуклеотиды, из которых в дальнейшем в результате восс˝тано-

вительных реакций образуются дезоксирибонуклеотиды.

Пиримидиновые рибонуклеотиды синтезируются из аспарагиновой кислоты и карбамоилфосфата, на образование котор˝ого

используются аммонийный азот, бикарбонат-ионы и молекулы˝

АТФ (с. 447). Под действием фермента карбамоилтрансферазы

карбамоильная группировка карбамоилфосфата переноситс˝я на

остаток аспарагиновой кислоты, и в результате отщепления молекулы воды из указанных компонентов синтезируется моле˝кула

дигидрооротовой кислоты. На следующем этапе дигидроорот˝о-

вая кислота окисляется флавиновым ферментом, который от-

щепляет от нее атомы водорода и переносит их на окисленны˝е

динуклеотиды НАД+. В результате этой реакции образуется оротовая кислота:

Далее в реакции вступает рибозо-5-фосфат, который вначале

активируется путем фосфорилирования от АТФ и превращается в 5-фосфорибозил-1-пирофосфат:

521

Источником рибозо-5-фосфата для синтеза нуклеотидов слу-

жат реакции цикла Кальвина и пентозофосфатного цикла.

Образовавшийся фосфорибозилпирофосфат при взаимодей-

ствии с оротовой кислотой дает первичный нуклеотид — ор˝оти-

дин-5-фосфат, который в результате декарбоксилирования пр˝е- вращается в уридин-5-фосфат (УМФ):

В ходе реакций фосфорилирования из УМФ синтезируются

УДФ (уридиндифосфат) и УТФ (уридинтрифосфат):

ЦТФ (цитидинтрифосфат), необходимый для синтеза РНК, об-

разуется из УТФ в результате аминирования азотистого осн˝ования

в составе нуклеотида. Донором аминной группы служит амидн˝ая

522

группировка глутамина. Реакция аминирования сопряжена с˝ гидролизом АТФ до АМФ:

Исходным соединением для синтеза пуриновых нуклеотидов˝, как и пиримидиновых, служит фосфорибозилпирофосфат, к кот˝о- рому присоединяются радикалы глутамина, глицина, аспараг˝иновой кислоты, углеродсодержащие группировки СО2, формил- и

метенилтетрагидрофолиевой кислоты. В ходе довольно слож˝ных

превращений постепенно в соединении с фосфорибозильным˝ радикалом строится структура азотистого основания. На ряде˝ этапов построение гетероциклической группировки азотистого ос˝нования сопряжено с гидролизом АТФ.

Первичным пуриновым нуклеотидом, который синтезируется˝ в

процессе указанных превращений, является инозиновая кис˝лота (ИМФ). Два атома углерода азотистого основания ИМФ гипоксантина включены в его гетероциклическую группировку и˝з мо-

лекул глутамина (амидный азот), один атом азота из аспараг˝ино-

вой кислоты и еще один атом азота из аминной группы глицин˝а.

Кроме того, глицин является также донором двух атомов угл˝ерода.

Еще два атома углерода гипоксантина происходят от формил˝ьных

523

группировок 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты (5,10-ме- тенил-ТГФК) и 10-формилтетрагидрофолиевой кислоты (10-фор- мил-ТГФК). Донором карбонильной группы гипоксантина служит СО2.

В результате аминирования от аспарагиновой кислоты в ход˝е двухэтапного превращения из инозиновой кислоты синтези˝руется

адениловая кислота. В связи с тем что эта реакция эндергон˝ичес-

кая, она сопряжена с гидролизом ГТФ:

При окислении инозиновой кислоты НАД-зависимой дегидро-

геназой происходит ее превращение в ксантиловую кислоту˝, которая далее в результате аминирования от глутамина и сопряж˝енного гидролиза АТФ образует гуаниловую кислоту (ГМФ):

524

Из соответствующих монофосфатов далее синтезируются ди˝-

фосфат- и трифосфатпроизводные пуриновых нуклеотидов. АД˝Ф

и АТФ образуются в результате субстратного или окислител˝ьного

фосфорилирования АМФ:

По аналогичной схеме в результате фосфорилирования от АТ˝Ф из ГМФ синтезируются ГДФ и ГТФ:

Таким образом, нами рассмотрены механизмы образования пи˝-

римидиновых и пуриновых рибонуклеотидов и их трифосфатп˝ро-

изводных, необходимых для синтеза рибонуклеиновых кисло˝т и

использования в качестве макроэргических соединений.

525

Дизоксирибонуклеотиды образуются из дифосфатпроизводн˝ых (у некоторых организмов из трифосфатов) рибонуклеотидов˝ при их восстановлении ферментом рибонуклеотидредуктазой, который переносит ко второму углеродному атому рибозы водород от˝ вос-

становленной формы белка тиоредоксина с образованием воды, окисленного тиоредоксина и дезоксирибозы в составе нуклеотида:

Восстановление окисленной формы тиоредоксина катализир˝у-

ет фермент тиоредоксинредуктаза, который переносит электроны

èпротоны на тиоредоксин от восстановленного НАДФ · Н:

Âходе указанных реакций происходит синтез дАДФ из АДФ,

дГДФ из ГДФ и дЦДФ из ЦДФ. В результате фосфорилирования

дифосфатпроизводных образуются соответствующие трифос˝фаты дезоксирибонуклеотидов, необходимые для синтеза ДНК.

Более сложным путем осуществляется синтез дезокситимид˝и- ловой кислоты. У эукариот исходным соединением для ее обр˝азо-

вания служит дезоксицитидиндифосфат (дЦДФ). Превращение˝

дЦДФ в дезокситимидиловую кислоту (дТМФ) осуществляется˝ по следующей схеме:

526

В первой реакции происходит гидролитическое отщепление˝ от дЦДФ фосфорной кислоты, во второй — дезаминирование цит˝о- зиновой группировки в составе нуклеотида и превращение е˝е в остаток урацила. Более сложное превращение происходит на˝ тре-

тьем этапе, которое катализирует фермент тимидилатсинтетаза. Под действием этого фермента осуществляется метилирова˝ние ос-

татка урацила в нуклеотиде с участием метилентетрагидро˝фолиевой кислоты и превращение его в остаток тимина:

В результате последующего фосфорилирования дТМФ от АТФ

образуется дизокситимидинтрифосфат (дТТФ), необходимый ˝для синтеза ДНК:

Важным этапом в синтезе дезокситимидиловой кислоты явля˝- ется обратное превращение дигидрофолиевой кислоты в мет˝и- лентетрагидрофолиевую кислоту. На первом этапе дигидроф˝оли-

евая кислота восстанавливается в тетрагидрофолиевую ки˝слоту

под действием фермента дигидрофолатредуктазы. Донорами электронов и протонов в этой реакции служат восстановленные динуклеотиды НАДФ · Н. Далее уже другой фермент серинтрансоксиметилаза переносит на тетрагидрофолиевую кислоту фор-

мильный остаток от серина, превращая последний в глицин.

Ферменты тимидилатсинтетаза и дигидрофолатредуктаза, с˝у-

щественно влияющие на скорость образования тиминовых ну˝кле-

527

отидов, являются активными инициаторами синтеза ДНК. При понижении их активности замедляется или прекращается об˝разование дезокситимидиловой кислоты, что приводит к прекращ˝е- нию синтеза ДНК. Подбирая эффективно действующие ингиби-

торы этих ферментов, можно при необходимости направленно˝ подавлять синтез ДНК в клетках организма. Такие ингибиторы ˝по-

ложены в основу химиотерапии рака, так как способны подав˝лять развитие раковых клеток, в которых интенсивно происходит˝ син-

òåç ÄÍÊ.

12.8.ПРОЦЕССЫ РАСПАДА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

ÈНУКЛЕОТИДОВ

Âклетках организмов постоянно происходит расщепление п˝о-

линуклеотидов на олиго- и мононуклеотиды с участием ферме˝н-

тов, называемых нуклеазами. Ранее уже рассматривалось действие

различных нуклеаз, участвующих в процессах репарации ДНК˝,

процессинге и сплайсинге РНК-транскриптов, быстрой дегра˝дации молекул мРНК. Нуклеазы катализируют гидролиз фосфоди˝-

эфирных связей в молекулах РНК и ДНК, а также их фрагментов˝.

Âзависимости от расщепляемого субстрата эти ферменты на˝зыва-

þò рибонуклеазами èëè дезоксирибонуклеазами.

Отдельные нуклеазы очень сильно различаются по специфич˝- ности действия и образуемым продуктам. Известны нуклеазы˝, об-

ладающие невысокой специфичностью. Они способны катализ˝и-

ровать гидролиз фосфоэфирных связей в одноцепочечных фр˝аг-

ментах РНК и ДНК с образованием олиго- и мононуклеотидов,

имеющих на 5′-конце фосфатные группировки. К таким фермен-

там относится нуклеаза S1, выделенная из Aspergillus oryzae.

Неспецифические рибонуклеазы могут действовать на двух˝це-

почечные участки РНК с образованием 5′- èëè 3′-фосфорилиро-

ванных олигонуклеотидов. Например, рибонуклеаза III Å. coli ãèä-

ролизует двутяжевые участки в молекулах РНК, образуя в ка˝честве конечных продуктов 3′-фосфорилированные олигонуклеотиды. Неспецифические дезоксирибонуклеазы гидролитически ра˝сщеп-

ляют двухцепочечные ДНК на олигоили мононуклеотиды, име˝-

ющие фосфатные группировки на 5′- èëè 3′-конце. Например, дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы животных расщеп-

ляет двуспиральные молекулы ДНК на олигонуклеотиды, кото˝рые фосфорилированы по 3′-концам.

Специфические нуклеазы осуществляют направленный гидро˝-

лиз полинуклеотидов, распознавая при своем действии или о˝пре-

деленные нуклеотидные радикалы, или специфические после˝до-

вательности нуклеотидных остатков в молекулах РНК или ДН˝К.

Так, гуаниловая рибонуклеаза Т1 актиномицетов направленно гид-

528

ролизует фосфодиэфирные связи в одноцепочечных РНК межд˝у остатками гуаниловой кислоты и любыми другими нуклеотидными остатками с образованием олигонуклеотидов, имеющих на 3¢-конце остатки гуанозин-3-фосфата.

Среди специфических дезоксирибонуклеаз наиболее хорошо˝ изучены рестриктазы, которые распознают в молекулах ДНК спе-

цифические последовательности из четырех—шести нуклеот˝идных остатков. Они расщепляют двухцепочечные молекулы ДНК˝

на строго определенные фрагменты. В качестве примера можн˝о

рассмотреть действие рестриктазы Eco RI из клеток E. ñoli. Ýòîò

фермент распознает в двуспиральной ДНК комплементарную˝

нуклеотидную последовательность и гидролитически расще˝пляет межнуклеотидные связи в положениях, указанных стрелками˝.

↓

ÃÀ À ÒÒÖ

ÖÒÒÀ ÀÃ

−

В результате действия этого фермента образуется специфи˝ческий набор двухцепочечных фрагментов ДНК, содержащих на 5¢-

концах остатки фосфорной кислоты. В связи с высокой специ˝-

фичностью действия рестриктазы широко используются для˝ выяс-

нения структуры нуклеиновых кислот.

Под действием набора разных нуклеаз нуклеиновые кислоты˝ гидролизуются до свободных нуклеотидов, которые далее по˝двер-

гаются распаду с участием гидролитических и окислительн˝ых фер-

ментов.

С участием нуклеотидаз нуклеотиды гидролизуются до нуклеозидов, которые далее под действием нуклеозидфосфорилаз подвергаются фосфоролизу, превращаясь в свободные азотистые ос˝нова-

ния и фосфорилированные остатки пентозы в виде рибозо-1-фо˝с-

фата или дезоксирибозо-1-фосфата. Распад нуклеиновых кисл˝от до азотистых оснований может быть представлен в виде след˝ующей схемы:

¾¾® Нуклеозиды ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾®Нуклеозидфосфорилазы Азотистые основания +

Í3ÐÎ4

+ Рибозо-1-фосфат (дезоксирибозо-1-фосфат)

Фосфорилированные пентозы включаются в углеводный об-

мен, а азотистые основания могут включаться в два типа био˝хими-

ческих процессов: вступать в синтез нуклеотидов или подвергать-

ся дальнейшему распаду.

529

Под действием ферментов фосфорибозилтрансфераз все азотистые основания, кроме тимина, способны взаимодействовать с˝ фосфорибозилпирофосфатом и снова включаться в рибонукл˝еотиды, которые далее используются для синтеза нуклеиновых ки˝слот.

В ходе распада азотистых оснований цитозин в результате г˝идролитического дезаминирования превращается в урацил, кото˝рый

восстанавливается НАДФ · Н в 5,6-дигидроурацил, последний подвергается гидролитическому расщеплению с образовани˝емβ-

аланина, СО2 è NH3:

В свою очередь, β-аланин может подвергаться окислительному

расщеплению и превращаться в малонил-КоА, который при де-

карбоксилировании дает ацетил-КоА. А возможные пути метаб˝о- лизма малонил-КоА и ацетил-КоА нам уже известны.

Тимин в процессе распада подвергается таким же превращен˝и-

ям, как и урацил, только вместо β-аланина образуется β-амино- изобутират, который окислительным путем превращается в м˝е- тилмалонил-КоА и далее в сукцинил-КоА, а последний включае˝т- ся в дыхательные реакции.

Пуриновые основания аденин и гуанин, подвергаясь гидроли˝-

тическому дезаминированию, превращаются соответственно˝ в ги-

530