Биохимия растений

Следуя логике указанных экспериментов, биохимики сформу˝- лировали очень важную закономерность, что полинуклеотид˝ные последовательности генов и полиаминокислотные последов˝ательности белков колинеарны, а именно полинуклеотидная после˝до-

вательность гена определяет полиаминокислотную последо˝вательность соответствующего полипептида.

Однако на примере изучения нуклеотидного состава ДНК и аминокислотного состава белков фагов и бактерий было опр˝еделе-

но, что в ДНК содержится значительно больше нуклеотидов, ч˝ем

аминокислотных остатков в составе всех белков, синтезируемых

клетками указанных организмов. Отсюда возникло предполо˝же-

ние, что каждый аминокислотный остаток полипептидной цеп˝и белка кодируется не одним нуклеотидом. Тем более было изв˝ест-

но, что в составе ДНК имеются только четыре вида нуклеотид˝ов, а

протеиногенных аминокислот — 18, и если учитывать еще два˝

амида, участвующих в построении белковых молекул, то полу˝чит-

ся 20 протеиногенных аминокислот.

Даже если предположить, что каждый аминокислотный оста-

ток белка кодируется последовательностью из двух нуклео˝тидов в

структуре гена, то получится только 16 комбинаций нуклеоти˝дов

из четырех по два, что тоже недостаточно для кодирования

20 аминокислотных остатков. Только комбинации нуклеотидных последовательностей из четырех по три обеспечивают коди˝рова-

ние указанного количества протеиногенных аминокислот. В˝сего

их образуется 64, поэтому возникает вопрос: все ли комбинаци˝и,

включающие последовательности из трех нуклеотидов, испо˝льзу-

ются для кодирования аминокислотных остатков в составе б˝елков? Ответ на этот вопрос был получен в 1961 г. М. Ниренбергом и Г. Маттэи, которые изучали роль различных РНК в качестве м˝ат-

риц для синтеза белков. Они проводили опыты с использован˝ием системы синтеза белков in vitro. Эта система включала неочищен-˝ ный экстракт растворимых веществ из клеток кишечной пало˝чки (E. ñoli), содержащий молекулы тРНК и ферменты, катализирую-

щие связывание аминокислот с тРНК. В этот экстракт добавл˝яли

рибосомы, выделенные из клеток кишечной палочки, все прот˝еиногенные аминокислоты, а также систему, генерирующую синт˝ез АТФ.

Когда в такую систему синтеза белков ввели в качестве мат˝ри-

цы, кодирующей структуру полипептида, синтетический поли˝-

нуклеотид, образованный из остатков уридиловой кислоты, с˝оединенных фосфодиэфирными связями (поли-У), то в качестве про˝- дукта синтеза был обнаружен полипептид, построенный из по˝вто-

ряющихся остатков фенилаланина, хотя в системе синтеза бе˝лков

содержались все протеиногенные аминокислоты. Если же в ка˝че-

стве матрицы для синтеза белков использовали полинуклео˝тид из

481

повторяющихся остатков цитидиловой кислоты (поли-Ц), то пр˝о- дуктом синтеза являлся полипептид, построенный из повтор˝яющихся остатков пролина. При использовании в качестве матр˝ицы в системе синтеза белков полинуклеотида поли-А образовыв˝ался

полипептид, состоящий из остатков лизина.

Если следовать концепции кодирования аминокислотных ос˝-

татков в белках последовательностью из трех нуклеотидов˝, то из результатов опытов М. Ниренберга и Г. Маттэи следовало, что˝ ос-

таток аминокислоты фенилаланина в полипептидных цепях б˝ел-

ков кодируется в мРНК последовательностью из трех нуклео˝тидов

УУУ, остаток пролина — ЦЦЦ, остаток лизина — ААА. Указанн˝ые

последовательности из трех нуклеотидов в полипептидных˝ цепях мРНК, кодирующие определенные аминокислотные остатки в

структуре белков, было предложено называть триплетами èëè кодонами.

В дальнейшем Х. Г. Корана синтезировал искусственные пол˝и-

нуклеотиды с известной и регулярно чередующейся последо˝вательностью нуклеотидов. В ходе изучения аминокислотного˝ со-

става полипептидов, синтезирующихся при использовании у˝ка-

занных искусственных полинуклеотидов в качестве матриц˝ в сис-

теме синтеза белков in vitro, были выяснены все другие триплеты˝,

кодирующие аминокислотные остатки в структуре белков.

На основе полученных данных составлена таблица, содержа-

щая 64 кодона триплетного генетического кода (табл. 12.2). В ней˝

указаны триплеты, кодирующие аминокислотные остатки (все˝го

их 61) и три терминирующих кодона (УАА, УАГ, УГА), которые

не кодируют аминокислотные остатки у большинства органи˝змов, а используются в качестве сигналов, прекращающих синтез н˝а рибосомах белковых полипептидов. Последовательности нукл˝еоти-

дов в кодонах записываются по такому же принципу, что и люб˝ая последовательность нуклеотидов в полипептидных цепях, к˝райним слева записывается нуклеотид на 5′-конце, а крайним справа — нуклеотид на 3′-конце.

12.2. Кодоны генетического кода*

482

* Справа от кодона указано сокращенное обозначение аминокислоты, которую кодирует данный кодон; Т(У) — в кодонах ДНК содержатся˝ остатки дезокситимидиловой кислоты (Т), а в кодонах РНК — уридиловой кисл˝оты (У); Терм. — терминирующий кодон.

Большинство аминокислотных остатков кодируются не одни˝м кодоном: остатки серина, аргинина и лейцина — шестью кодо˝нами; валина, пролина, треонина, аланина и глицина — четырьм˝я; изолейцина — тремя кодонами; другие аминокислотные ост˝атки — двумя кодонами. Только остатки метионина и триптофа˝на кодируются единичными кодонами. Выявленная неоднозначн˝ость в кодировании аминокислотных остатков получила названи˝евырожденности генетического кода. Благодаря вырожденности гене-

тического кода разные организмы могут синтезировать схо˝дные

по структуре белки, необходимые для выполнения одной и той же биологической функции. При этом выявлено, что у каждого˝ типа организмов обычно для кодирования определенной ами˝нокислоты используются из имеющегося набора кодонов не все˝, а только определенные один-два кодона. Явление вырожденнос˝ти кода может служить также защитой от мутаций, связанных с м˝о- дификацией или заменой отдельных нуклеотидов в структур˝е ДНК, в результате чего многие такие отклонения в нуклеоти˝д- ном составе ДНК не приводят к изменению аминокислотного

состава белков.

Вместе с тем сравнение нуклеотидного состава кодонов, код˝и- рующих один и тот же аминокислотный остаток в структуре белков, показывает, что первые два нуклеотида в кодоне (от 5′-кон- ца) несут бó льшую информационную нагрузку, чем третий. У восьми аминокислотных остатков (валина, пролина, треонина, ала˝ни-

на, глицина, серина, лейцина, аргинина) имеются группы из

четырех кодонов, в которых специфичность кодирования опр˝еделяется двумя первыми нуклеотидами, тогда как третий нукле˝отид

может быть любой. В кодонах фенилаланина, тирозина, цистеина,

483

гистидина, аспарагиновой кислоты и аспарагина третье пол˝ожение занимают только пиримидиновые нуклеотиды, а в кодонах лизина, глутаминовой кислоты и глутамина — пуриновые ну˝клеотиды. Отмечено также, что в кодонах дикарбоновых аминокис˝лот и их амидов второе положение занимает адениновый нуклеот˝ид, а

в кодонах наиболее типичных гидрофобных аминокислот — ˝уридиновый нуклеотид.

Важное свойство генетического кода, характерное для боль˝-

шинства организмов, — его неперекрываемость. Это означает˝, что последовательности кодонов, входящие в структуру разных генов,

занимают определенные участки в молекуле ДНК, которые в

структуре хромосом не перекрываются, а последовательно р˝асполагаются вдоль цепи ДНК. В составе каждого гена кодоны так˝же

не перекрываются, они последовательно следуют один за дру˝гим в

цепи ДНК, образующей данный участок.

Однако в геномах некоторых фагов найдены участки ДНК, в

которых локализованы перекрывающиеся гены. Благодаря на˝ли-

чию перекрывающихся генов у таких генотипов оказывается˝ возможным кодирование значительно большей генетической ин˝фор-

мации, чем это позволяют линейные размеры ДНК, ограничен-

ные числом содержащихся в ней нуклеотидов.

Âмногочисленных опытах с использованием различных сист˝ем

синтеза белков in vitro было показано, что генетический код уни˝-

версален для всех организмов. Если, например, в систему син˝теза белка, выделенную из клеток микроорганизмов, добавлять мР˝НК

животных, человека или растений, то в этой системе будут си˝нте-

зироваться белки указанных высших организмов. Универсал˝ь- ность генетического кода послужила основой для развития˝ нового

научного направления — генной инженерии.

Âоснову генетической инженерии положены биохимические˝ методы, позволяющие выделять определенные участки ДНК, со˝-

держащие отдельные гены, из клеток одного организма и пер˝ено-

сить их в клетки другого организма, где они включаются в ДН˝К хромосом и становятся источниками генетической информа˝ции

для синтеза соответствующих белков, которые улучшают сво˝йства

данного организма или могут быть использованы в качестве˝ биокатализаторов для производства пищевых продуктов и меди˝цинс-

ких препаратов в биотехнологической промышленности.

Однако у некоторых организмов найдены особенности кодир˝о- вания аминокислотных остатков в белках, которые отличают˝ся от универсального генетического кода, представленного в та˝бли-

це 12.2. Так, было установлено, что в митохондриальных генах

дрожжей и млекопитающих триптофан кодируется не только триплетом УГГ, но и кодоном УГА, который в универсальном ге˝-

484

нетическом коде является терминирующим кодоном. В митохо˝ндриальных генах человека триплет АУА кодирует метионин, а ˝в универсальном коде — изолейцин, триплеты АГА и АГГ выпол˝ня-

ют роль терминирующих кодов, а в универсальном коде они ко˝ди-

руют аргинин. В митохондриальных генах различных организ˝мов

отмечаются и некоторые другие отклонения от универсальн˝ого ге-

нетического кода.

12.4. СИНТЕЗ ДНК

Различными методами показано, что в период, предшествую-

щий делению клеток, количество ДНК в них удваивается. При этом синтез ДНК осуществляется таким образом, что и в дочер-

них, и в материнских клетках содержатся совершенно иденти˝чные

молекулы ДНК. Это означает, что в процессе синтеза реализуется

механизм воспроизведения структуры ДНК, который обеспеч˝ива-

ет передачу наследственных свойств в ходе размножения кл˝еток. Механизм образования в клетках организмов новых молекул˝

ДНК, которые идентичны по генетическим свойствам уже имею˝-

щимся молекулам, называют репликацией ДНК.

Первые представления о механизме удвоения ДНК вытекали из

модели строения молекул ДНК Д. Уотсона и Ф. Крика, которая˝ представляет собой двойную спираль, состоящую из двух ком˝пле-

ментарных полинуклеотидных цепей. Если такие цепи разъед˝и-

нить и использовать в качестве матрицы (шаблона) для синте˝за

новой цепи ДНК, то в процессе синтеза будет выстраиваться по-

линуклеотидная цепь, которая по всем нуклеотидам комплем˝ен-

тарна исходной цепи ДНК.

Таким образом, каждая из двух разъединенных цепей ДНК

дает начало новой двухцепочечной структуре, которая по по˝сле-

довательности в ней нуклеотидных остатков не отличается˝ от исходной молекулы ДНК, используемой в качестве матрицы при синтезе новой молекулы ДНК. Принцип изложенного выше механизма удвоения ДНК может быть представлен в виде следую˝-

щей схемы:

485

Экспериментальное подтверждение механизма репликации ДНК было получено в 1958 г. М. Мезелсоном и Ф. Сталем, которые выполнили эксперименты с использованием тяжелого из˝отопа азота 15N. Путем длительного выращивания кишечной палочки (E. ñoli) на среде, содержащей в качестве источника азота 15NH4Cl, они получили клетки, в которых молекулы ДНК были полность˝ю насыщены 15N. Затем клетки перенесли в среду с источником азо-

òà â âèäå 14NH4Cl и начали отбирать пробы после появления каждой новой генерации клеток.

Из каждой пробы выделяли ДНК и подвергали ультрацентри-

фугированию в градиенте плотности хлористого цезия. В ход˝е опытов было определено, что в первом поколении клеток пос˝ле их высаживания на среду с 14N в составе ДНК только половина азота была представлена в виде 15N, а вторую половину составлял изо-

486

ДНК на одноцепочечной матрице, если на ней уже содержится˝ небольшой олигонуклеотидный фрагмент, комплементарный ˝нуклеотидным остаткам матрицы. Это так называемая затравка, у которой на 3′-конце имеется свободная гидроксильная группа. Суб-

стратами для построения синтезируемой полинуклеотидной˝ цепи ДНК служат дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, т. е. дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ. Порядок присоединения фосфорилированных нуклеотидных остатков определяется их комплементар˝ным взаимодействием с соответствующими нуклеотидными остат˝ками на ДНК-матрице, с которыми они образуют водородные связи.

В ходе реакции под действием фермента осуществляется гид˝ролиз макроэргической связи дезоксинуклеозидтрифосфата и˝ высвобождение пирофосфата, а нуклеотидный остаток в виде дезоксинуклеозидмонофосфата присоединяется к 3′-ОН затравки. Так последовательно происходит наращивание синтезируемой п˝олинуклеотидной цепи ДНК в направлении от 5′-конца к 3′-концу. Вновь синтезируемая цепь ДНК комплементарна и антипарал˝- лельна полинуклеотидной цепи матрицы, что отвечает принципам построения двойной спирали ДНК. Реакция, катализируе-˝ мая ДНК-полимеразой, может быть представлена в виде следующей схемы:

3′-Конец затравки со свободной НО-группой

Образующийся в указанной реакции пирофосфат расщепляет˝- ся пирофосфатазой, что предотвращает ход обратной реакци˝и,

487

вызывающей распад полинуклеотидов ДНК. Последовательно˝сть присоединения нуклеотидных остатков в ходе матричного с˝интеза ДНК можно представить следующим образом:

Затравка

ДНК-полимеразы осуществляют синтез полинуклеотидных це˝-

пей ДНК с очень высокой скоростью. Например, в клетках бакт˝е- рий скорость этого процесса составляет около 1000 н. о. за 1 с.˝ В

клетках высших организмов — несколько десятков нуклеот˝идных

остатков за 1 с (около 100). Однако даже при такой высокой ско-

рости синтеза фермент действует очень точно и вероятност˝ь при-

соединения неправильного нуклеотидного остатка обычно ˝не превышает 10–6—10–8, т. е. одна ошибка на десятки миллионов нукле-

отидных остатков.

ДНК-полимераза с высокой точностью присоединяет к 3′-êîí-

цу растущей цепи ДНК нуклеотидные остатки, которые компле˝-

ментарны нуклеотидам матрицы. При этом правильность прис˝оединения каждого нуклеотидного остатка контролируется ф˝ермен-

том дважды. Первый раз, когда присоединяется очередной ну˝кле-

отидный остаток, и второй раз, когда присоединяется следу˝ющий

нуклеотидный остаток. Если предшествующий нуклеотидный˝ остаток некомплементарен матрице, то следующая фосфоэфирн˝ая связь не образуется до тех пор, пока неправильный нуклеот˝идный

остаток не будет удален и его место не займет правильная н˝уклео-

тидная группировка. В связи с этим некоторые ДНК-полимера˝зы не только способны катализировать синтез ДНК, но и облада˝ют 3′-экзонуклеазной активностью, которая обеспечивает удале˝ние некомплементарного матрице нуклеотидного остатка на 3′-конце

синтезируемой цепи ДНК.

Как было указано ранее, ДНК-полимеразы присоединяют нуклеотиды в ходе синтеза ДНК к 3′-концам олигонуклеотида, называемого затравкой, комплементарно присоединенного к мат˝рице.

Однако эти ферменты не способны инициировать синтез ДНК н˝а

одноцепочечной матрице. Поэтому образование олигонукле˝оти-

да затравки катализирует другой фермент, который назвали˝

ДНК-праймазой. Этот фермент катализирует присоединение к матричной цепи ДНК нескольких остатков рибонуклеотидов˝,

488

формирующих короткую затравочную цепь РНК, которая компл˝е- ментарна матричной цепи и образует с ней двойную спираль.˝ Именно к 3′-концу РНК-затравки присоединяются далее остатки

дезоксирибонуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы. После

того как синтез новой ДНК-цепи заканчивается, РНК-затравк˝и

удаляются специальным ферментом, который проявляет 5′-ýêçî-

нуклеазную активность, т. е. отщепляет от полинуклеотидной

öåïè 5′-концевые нуклеотидные остатки.

Âклетках бактерий выявлены три вида ДНК-полимераз — I, II,

èIII.

ДНК-полимераза I представляет собой белок с молекулярной

массой 102 000, обладающий тремя видами каталитической актив˝-

ности. Он способен удалять неправильно присоединенные ил˝и из-

мененные в результате мутации нуклеотидные остатки за сч˝ет проявления 3′-экзонуклеазной активности и присоединять вместо

них правильные нуклеотидные остатки, комплементарные ма˝т-

ричной ДНК. Кроме того, за счет 5′-экзонуклеазной активности

этот фермент катализирует удаление РНК-затравки и достра˝ива-

ние вместо нее полинуклеотидной цепи ДНК.

ДНК-полимераза II, молекулярная масса которой около 120 000,

обладает как полимеразной, так и 3′-экзонуклеазной активностью.

Она присоединяется к двухцепочечной ДНК и катализирует н˝а од-

ной из цепей ДНК образование фрагментов длиной в нескольк˝о

десятков нуклеотидов. Важную роль этот фермент играет в п˝роцессах репарации ДНК, направленных на удаление из ДНК измене˝н-

ных под воздействием мутагенов нуклеотидных остатков.

ДНК-полимераза III — главный фермент, катализирующий

репликацию ДНК. Он состоит из семи разных субъединиц, обра˝- зующих олигомерную молекулу с молекулярной массой около˝ 500 000. Ферментный белок присоединяется к двухцепочечной затравке и катализирует далее синтез новой цепи ДНК на ДН˝К-

матрице. На активирование ДНК-полимеразы III в процессе при-˝

соединения к матрице затрачивается энергия, которая обес˝печи- вается в результате гидролиза макроэргической связи АТФ с образованием АДФ и фосфорной кислоты.

В клетках высших организмов имеются аналогичные фермент˝ы,

обладающие ДНК-полимеразной активностью. Основной ферме˝нт

репликации ДНК в ядрах клеток — ДНК-полимераза α, в составе которого содержится также полипептидная субъединица ДН˝К- праймазы, способная катализировать синтез РНК-затравки. Д˝НК-

полимераза β, как и ДНК-полимераза II бактерий, участвует в репа-

рации ДНК. ДНК-полимераза γ катализирует синтез ДНК в митохондриях. Аналогичный фермент найден в хлоропластах раст˝ений.

У бактерий репликация ДНК начинается в определенном учас˝т-

ке хромосомы, который сокращенно обозначают ori (от английс-

489

5′

3′

1 — хеликаза; 2 — топоизомераза; 3 — SSB-белки; 4 — РНК-затравки; 5 — фрагменты Оказаки; 6 — ведущая цепь синтезируемой ДНК; 7 — отстающая цепь синтезируемой ДНК; 8 — место действия ДНК-лигазы

кого слова origin — начало). Этот участок хромосомы имеет спец˝и-

фическую последовательность нуклеотидов, узнаваемую од˝ним из

белков, участвующим в инициации синтеза ДНК. Его называют˝

инициаторным белком. При этом может быть однонаправленна˝я репликация, когда ферменты репликации движутся в одном на˝-

правлении. Возможен также двунаправленный синтез ДНК, ког˝да

репликация ДНК от участка хромосомы, обозначаемого ori, îñó-

ществляется в двух противоположных направлениях. В хромо˝сомах высших организмов репликация начинается одновремен˝но на многих участках, расстояние между которыми составляет по˝рядка 100 000 нуклеотидных остатков.

После того как инициаторный белок связывается с участком˝

ÄÍÊ ori, к этому участку присоединяется в определенной после-

довательности комплекс из шести белков, главным из которы˝х является хеликаза. Это — АТФ-зависимый фермент, использующий энергию гидролиза АТФ для разъединения полинуклеотидны˝х цепей двойной спирали ДНК. Ферментный белок хеликазы, присо˝е-

динившись к одной из цепей ДНК, движется вдоль этой цепи и

расплетает перед собой двойную спираль ДНК, образуя репликативную вилку, которая включает участок двойной спирали ДНК и две отходящие от него одноцепочечные ветви (рис. 12.6).

Самопроизвольное объединение в двойную спираль образов˝ав-

шихся под действием хеликазы одноцепочечных участков ДН˝К

предотвращают специальные белки, которые имеют избирате˝ль-

ное сродство к разъединенным полинуклеотидным цепям ДНК˝.

490