Биохимия растений

щей ситез АТФ по такому же механизму, как и в митохондриях. Одновременно из электронтранспортной цепи системы окис˝лительного фосфорилирования через ферредоксин осуществля˝ется вывод электронов на Fe, S-белки нитрогеназы, которые сопря-

женно с гидролизом АТФ переносят их на активные группиров˝- ки Mo, Fe-белков.

Часть метаболитов растения, поступающих в бактероиды, пре˝- вращается в полиэфир b-оксимасляной кислоты, который служит

запасным веществом в клетках бактерий и бактероидах клуб˝ень-

ков. Поли-b-оксимасляная кислота откладывается в специальных

гранулах, и ее содержание изменяется в зависимости от про˝цесса

азотфиксации. При усилении азотфиксации содержание поли˝- эфира b-оксимасляной кислоты в клубеньках уменьшается, а при

ослаблении указанного процесса происходит его накоплен˝ие.

Поскольку нитрогеназа инактивируется кислородом, клетк˝а

бактероида защищена от его проникновения внешней мембра˝ной.

Однако в системе окислительного фосфорилирования конеч˝ным акцептором электронов служит кислород, который вводится˝ в

бактероид в связанном состоянии специальным белком легоглобином. Легоглобины представляют собой гемопротеиды с молеку-

лярной массой 15—16 тыс., которые синтезируются клетками рас˝-

тения. Как и гемоглобин крови человека и животных, легогло˝бин содержит активную группировку в виде протогема, с которой˝ свя-

зывается молекулярный кислород, образуя оксилегоглобин˝. В та-

ком виде обеспечиваются транспорт кислорода через мембр˝ану

бактероида и передача его на активный центр терминальной˝ окси-

дазы электронтранспортной цепи бактероида, где кислород˝ акцептирует электроны.

Кроме молекул азота, ферментный комплекс нитрогеназы од-

новременно восстанавливает также катионы водорода в мол˝екулярный водород в соответствии с реакцией 2H+ +2e ¾¾® H2 . Ïî-

этому наряду с аммиаком продуктом действия нитрогеназы я˝вляется также молекулярный водород, при окислении которого у˝ некоторых штаммов клубеньковых бактерий осуществляется дополнительный синтез АТФ, необходимого для азотфиксаци˝и. Окисление водорода катализирует фермент гидрогеназа. В опытах показано, что штаммы клубеньковых бактерий, способные к с˝интезу гидрогеназы, обеспечивают более интенсивную фиксац˝ию молекулярного азота, вследствие чего повышается продукт˝ивность

бобовых растений, инфицированных этими видами клубенько˝вых

бактерий.

Для питания бактероида субстратами цикла Кребса использ˝уется не только СО2, фиксированный в процессе фотосинтеза, но и

диоксид углерода, поступающий в клубеньки из почвы или вы˝де-

461

ляющийся как продукт дыхания в клетках клубеньков. Нефото˝- синтетическую фиксацию СО2 в растительных клетках клубеньков катализирует фермент фосфопируваткарбоксилаза с образо˝ванием щавелевоуксусной кислоты. Затем щавелевоуксусная кисло˝та по

уже известным нам механизмам превращается в яблочную и ян˝- тарную кислоты. За счет гетеротрофной фиксации СО2 в бактеро-

иды поступает до 25 % углерода, находящегося в составе субст˝ратов цикла Кребса.

Продукт восстановления в бактероидах молекулярного азо˝та —

аммиак — транспортируется из бактероида в цитоплазму р˝асти-

тельных клеток клубеньков в виде катионов аммония или ала˝ни-

на, который синтезируется при участии аланиндегидрогена˝зы бактероидов из поступающей в бактероиды пировиноградной ки˝сло-

ты растительного происхождения. В цитоплазме растительн˝ых

клеток клубеньков локализован фермент глутаминсинтетаз˝а, ката-

лизирующий синтез глутамина, а в пластидах — глутаматси˝нтаза, с

участием которой синтезируются молекулы глутаминовой к˝ислоты. Под действием указанных ферментов, а также аминотранс˝фе-

раз в клубеньках осуществляется синтез транспортных фор˝м азо-

тистых веществ — глутамина и аспарагина, которые далее п˝ерено-

сятся по транспортной системе растения в другие органы. У˝ неко-

торых бобовых (соя, фасоль, вигна) транспортными формами азота служат аллантоин и аллантоиновая кислота, являющие˝ся

продуктами нуклеотидного обмена (см. с. 530—532). Таким обра-

зом, бобовые растения, имеющие активные клубеньки, практи˝-

чески полностью обеспечивают свои потребности в восстан˝овлен-

ных формах азота за счет симбиотической азотфиксации. Эффективность азотфиксации в клубеньках бобовых растен˝ий

тесно связана с интенсивностью фотосинтеза. Факторы, влия˝ю-

щие на процессы фотоассимиляции, соответствующим образо˝м влияют и на скорость усвоения растениями молекулярного а˝зота. Особенно заметно снижается симбиотическая азотфиксация˝ у бобовых при недостаточном их питании молибденом и кобальто˝м.

Как мы уже знаем, молибден входит в состав активной группи˝ров-

ки Mo, Fe-белка нитрогеназы, а кобальт активирует ферменты в составе клубеньков, имеющие в качестве коферментов кофер˝ментные формы витамина В12.

У цианобактерий наблюдаются разные формы симбиоза в зави˝-

симости от растения. Так, например, цианобактерии из рода

Nostoc при симбиозе с водным папоротником Azolla проникают в полости листа, увеличиваются в размерах и покрываются пло˝тной оболочкой, превращаясь в способные к азотфиксации структ˝у-

ры — гетероцисты. Восстановленный азот в виде аммонийно˝й

формы транспортируется в окружающие гетероцисты клетки˝ лис-

та и включается в обмен азотистых веществ растения.

462

Цианобактерии этого рода способны также к симбиозу с цвет˝- ковыми растениями из рода Gunnera. Через специальные железы у основания черешков листьев они проникают во внутреннюю п˝о- лость листьев и инфицируют растительные клетки. Внутри ни˝х

цианобактерии превращаются в гетероцисты, способные фик˝сировать молекулярный азот атмосферы, превращая его в аммон˝ий-

ную форму, которая транспортируется в цитоплазму инфицир˝о- ванных растительных клеток и включается в состав аминоки˝слот и

амидов, обеспечивая таким образом растение восстановлен˝ными

формами азота.

Кроме симбиотических азотфиксаторов молекулярный азот ˝ат-

мосферы усваивают также некоторые свободноживущие микр˝оорганизмы. К ним относятся аэробные бактерии родов Azotobacter è Beiyerinckia, анаэробные бактерии из рода Clostridium, отдельные

виды цианобактерий и фотосинтезирующих бактерий. Их вкла˝д в

обогащение почвы биологически связанным азотом менее зн˝ачи-

телен, чем симбиотических микроорганизмов, при благоприя˝тных условиях ежегодная фиксация ими азота может достигать 30—˝

40êã/ãà.

Óанаэробных азотфиксаторов источником энергии и электр˝о-

нов для восстановления молекулярного азота служат проце˝ссы

брожения, у аэробных форм — процесс аэробного дыхания, у ˝фотосинтезирующих бактерий — продукты фотосинтеза. Все о˝ни

способны синтезировать ферментный комплекс нитрогеназы˝, ка-

тализирующий в их клетках восстановление молекул азота д˝о ам-

миачной формы. Донорами электронов для нитрогеназы служа˝т

бактериальный ферредоксин и его молекулярные аналоги. Не˝- которые виды несимбиотических азотфиксаторов (Azotobacter,

Beiyerinckia, Azospirillium, Flavobacterium) обитают на поверхности

корней растений, так как в качестве энергетических продук˝тов используют их корневые выделения. Значительный вклад в обог˝ащение рисовых полей азотом за счет азотфиксации вносят циан˝обактерии из рода Tolypothrix.

Наряду с изучением биохимических механизмов процесса аз˝от-

фиксации у свободноживущих и симбиотических микроорган˝измов проводятся также молекулярно-генетические исследов˝ания, связанные с направленным воздействием на систему, регули˝рующую синтез ферментов азотфиксации. Цель таких работ — до˝бить-

ся усиления синтеза нитрогеназы и других ферментов, участ˝вую-

щих в восстановлении и связывании молекулярного азота, и ˝таким образом повысить эффективность биологической фикса˝ции азота атмосферы и его использования сельскохозяйственн˝ыми

растениями. Кроме того, разрабатываются молекулярные под˝ходы

переноса генов азотфиксации из клеток микроорганизмов в˝ гено-

типы растений. Это особенно актуально для злаковых растен˝ий,

463

занимающих ведущее положение среди возделываемых сельс˝кохозяйственных культур. С использованием методов генетичес˝кой инженерии в различных лабораториях предпринимаются поп˝ытки создания таких генотипов злаковых растений, которые, подо˝бно

бобовым, были бы способны усваивать молекулярный азот, со˝держащийся в земной атмосфере.

Контрольные вопросы. 1. Каков механизм восстановительного аминирования кетокислот, образующихся в реакциях дыхания? 2. Какие реакц˝ии катализируют ферменты глутаматсинтаза и аспартатаммиаклиаза? 3. Какое ˝значение в синтезе и превращениях аминокислот имеют реакции переаминировани˝я? 4. Как синтезируются в растениях серин, орнитин, пролин, лизин, метионин, ˝цистеин, треонин, валин, лейцин и изолейцин? 5. В ходе каких биохимических пре˝вращений осуществляется синтез ароматических аминокислот, гистидина и˝ триптофана? 6. Какие продукты образуются в реакциях орнитинового цикла? 7. Каки˝м путем происходит распад аминокислот и превращения продуктов их распад˝а? 8. Как синтезируются азотистые основания этаноламин и холин? 9. В ходе каких˝ биохимических реакций осуществляется связывание избыточного аммиака ˝в растительных тканях? 10. Каковы механизмы ассимиляции растениями азота моче˝вины при некорневых подкормках? 11. Как восстанавливается в растениях нит˝ратная форма азота? 12. При каких условиях происходит накопление нитратов в ˝растительных тканях? 13. Как осуществляется синтез аминокислот при симбиоти˝ческой азотфиксации? 14. Какие биохимические процессы происходят в бактерои˝дах клубеньков бобовых растений?

464

12. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. ОБМЕН НУКЛЕОТИДОВ И БЕЛКОВ

∙

Нуклеиновые кислоты (НК) — это биологические полимеры, молекулы которых построены из нуклеотидов. Эти вещества были

открыты в 1868 г. Ф. Мишером, который выделил их из ядер кле-

ток лейкоцитов и поэтому назвал нуклеином (ядро по-гречес˝ки — nucleus). Поскольку НК обладают кислотными свойствами, вновь

открытые химические соединения в дальнейшем стали назыв˝ать нуклеиновыми кислотами. Длительное время нуклеиновым ки˝с-

лотам отводилась второстепенная роль в жизнедеятельнос˝ти орга-

низмов. И только в 1940—1950 гг. было показано, что эти хими-

ческие соединения ответственны за наследственность и ре˝ализа-

цию генетических свойств у всех живых организмов.

В зависимости от состава и строения образующих их молекул˝

нуклеотидов различают два вида нуклеиновых кислот: дезок˝сири-

бонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РН˝К).

Молекулы ДНК образуются из дезоксирибонуклеотидов в осн˝ов-

ном четырех видов — дезоксиадениловой кислоты (дАМФ), де˝зоксигуаниловой кислоты (дГМФ), дезоксицитидиловой кислоты˝

(дЦМФ) и дезокситимидиловой кислоты (дТМФ). Молекулы

РНК синтезируются из рибонуклеотидов — адениловой кисло˝ты

(АМФ), гуаниловой кислоты (ГМФ), цитидиловой кислоты (ЦМФ) и уридиловой кислоты (УМФ).

Нуклеотидный состав ДНК и РНК:

465

Кроме указанных нуклеотидов в составе нуклеиновых кисло˝т в

небольшом количестве содержатся и некоторые другие нукл˝еоти-

äû (ñì. ñ. 68).

ДНК содержится в вирусах, клетках низших организмов (про-

кариот) и в ядрах клеток высших организмов (эукариот), а так˝же

âмитохондриях и хлоропластах высших организмов. Кроме то˝го,

âцитоплазме прокариот и эукариот найдены малые кольцевы˝е

ДНК. В составе растительной ДНК значительная часть цитози˝на

âостатках нуклеотидов метилирована (до 25 %) и содержится в˝ виде 5-метилцитозина, с участием которого образуется еще одна

разновидность нуклеотидов — 5-метилдезоксицитидиловая˝ кис-

лота. РНК в основном локализованы в цитоплазме клеток, где˝ они являются главными факторами, инициирующими синтез

ферментов и других белков. В составе многих растительных ˝ви-

русов в качестве основного генетического материала соде˝ржится не ДНК, а РНК.

Молекулы нуклеиновых кислот представляют собой длинные˝ цепочки, состоящие из остатков нуклеотидов, которые соеди˝не-

ны через остатки ортофосфорной кислоты фосфодиэфирными˝

связями. В образовании фосфодиэфирных связей участвуют г˝ид-

роксильные группы рибозы или 2-дезоксирибозы, связанные с˝ третьим и пятым углеродными атомами. Однако на концах обр˝а-

зуемой полинуклеотидной цепи остаются свободные гидро-

ксильные группы у третьего и пятого углеродных атомов риб˝озы или дезоксирибозы, которые обозначают 3′—ÎÍ è 5′—ÎÍ. Ñî-

ответствующие концы полинуклеотидной цепи, содержащие

3′—ÎÍ è 5′—ОН, называют 3′- è 5′-концами. На прочность фосфоэфирных связей в составе полинуклеотидных цепей оказы˝ва-

ют влияние углеводные компоненты образующих эти цепи нук˝-

леотидов — рибозы или дезоксирибозы. Межнуклеотидные с˝вязи

âмолекулах РНК значительно лабильнее, чем в ДНК, поэтому они легче подвергаются гидролизу. Последовательность со˝единения нуклеотидных остатков в молекулах нуклеиновых кисло˝т фосфодиэфирными связями может быть представлена в виде с˝ледующей схемы:

466

Число нуклеотидных остатков в молекулах нуклеиновых киcлот очень велико и варьирует в зависимости от вида орга˝низмов. Молекулы РНК могут включать от 70 до 100 тыс. нуклеотидных остатков (н. о.). Еще длиннее полинуклеотидные цепи

ДНК: у вирусов — до 8—10 тыс. н. о., бактерий и других микро-

организмов — 106—107, у высших организмов — 108—1010 н. о. Чередование нуклеотидных остатков в полинуклеотидной ц˝епи зависит от вида организмов. Поскольку она строится из чет˝ырех типов нуклеотидов, может возникнуть огромное разнообраз˝ие

макромолекул, общее число которых определяется по формул˝е

N = 4n, ãäå n — общее количество нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи. Например, если молекула нуклеиновой ки˝с- лоты построена из 1000 нуклеотидных остатков, то, исходя из вы-

шеуказанных условий, может образоваться 41000 нуклеотидных

последовательностей, каждая из которых представляет соб˝ой молекулу определенного генотипа.

467

12.1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РОЛЬ И СТРОЕНИЕ ДНК

Впервые генетическая роль ДНК была установлена в опытах п˝о

изучению трансформации у бактерий. В 1928 г. Ф. Гриффит пока-

зал, что при введении в организм животных совместно с непа˝то-

генными штаммами пневмококков убитых нагреванием клето˝к

патогенного штамма животные погибали от пневмонии. Однак˝о

если животным вводили отдельно непатогенный штамм или кл˝ет-

ки убитого патогенного штамма, то заболевания пневмонией˝ не наблюдалось. В связи с этим возникло предположение, что ка˝кое-

то вещество, содержащееся в убитых клетках патогенного шт˝амма,

передает клеткам непатогенного штамма способность прот˝ивосто-

ять иммунной системе животных и поражать их пневмонией. Н˝а-

блюдаемое явление назвали трансформацией бактерий.

Для выявления трансформирующего фактора из убитых клето˝к

патогенного штамма были выделены в очищенном состоянии

ДНК, белки и некоторые другие химические компоненты, кото˝-

рые стали вводить в организм животных совместно с клеткам˝и не-

патогенного штамма. Проводя такие опыты, О. Эйвери, К. МакЛеод и М. Мак-Карти в 1944 г. установили, что трансформирую-

щим фактором у пневмококков является ДНК. Таким образом,

они впервые показали, что наследственная способность одн˝ой

клетки осуществлять определенную биохимическую функцию˝ мо-

жет передаваться другой клетке путем введения в нее ДНК, в˝ыделенной из первой клетки. После этого в ряде других опытов с˝ ви-

русами, бактериями и высшими организмами было подтвержде˝но,

что именно молекулы ДНК являются носителями генетическо˝й

информации, определяющей наследственные свойства орган˝измов.

Открытие генетической роли ДНК послужило активным импульсом для дальнейшего изучения состава, строения и свой˝ств

нуклеиновых кислот. При изучении Э. Чаргаффом химического˝

состава ДНК были выяснены закономерности ее нуклеотидно˝го состава, которые получили название правил Чаргаффа. Молекулы ДНК подвергали гидролизу, в ходе которого расщеплялись не˝ только фосфодиэфирные связи, соединяющие остатки нуклео˝ти-

дов, но и внутринуклеотидные связи между азотистым основа˝ни-

ем и дезоксирибозой, а также между дезоксирибозой и остат˝ком фосфорной кислоты.

После гидролиза определяли содержание азотистых основа˝ний.

При этом было отмечено, что в составе ДНК любых организмов˝

мольные соотношения пар оснований аденина и тимина, а так˝же гуанина и цитозина всегда равны. Наблюдалось также равенство

между суммой пуриновых и суммой пиримидиновых оснований˝,

тогда как суммарное количество аденина и тимина заметно о˝тли-

468

чалось от суммарного содержания гуанина и цитозина. Испол˝ьзуя сокращенные обозначения, отмеченные закономерности в со˝держании азотистых оснований в составе ДНК можно записать в ˝виде следующих соотношений:

À = Ò; Ã = Ö; À + Ã = Ò + Ö; À + Ò ¹ Ã + Ö.

Изучение нуклеотидного состава ДНК различных организмо˝в

показало, что соотношение пар азотистых оснований А + Т/Г˝ + Ц

является важным показателем специфичности ДНК у разных

организмов. Каждый вид организмов имеет свойственный ему˝

нуклеотидный состав ДНК. В таблице 12.1 показано содержание азотистых оснований в ДНК животных, растений и микроорга-˝

низмов.

12.1. Содержание и соотношение азотистых оснований в ДНК раз˝личных организмов

Нуклеотидный состав ДНК у одного и того же генотипа остае˝т-

ся постоянным в изменяющихся условиях окружающей среды, что является важнейшим фактором сохранения наследственных свойств организма.

Кроме особенностей нуклеотидного состава специфичность˝

ДНК, свойственная конкретному генотипу, определяется так˝же

последовательностью соединения остатков нуклеотидов в ˝полинуклеотидной цепи, которую называют первичной структурой ДНК. Каждый вид ДНК характеризуется совершенно определенной первичной структурой.

Последовательность нуклеотидных остатков в полинуклеот˝ид-

ной цепи записывают в виде сокращенных обозначений нукле˝оти-

дов слева направо, начиная от 5¢-конца. Буквенные обозначения нуклеотидов могут быть соединены черточками. Например, в ˝нук-

леотидной последовательности Т—Ц—Г—А—Ц—А слева направо˝

469

последовательно соединены фосфодиэфирными связями оста˝тки дТМФ, дЦМФ, дГМФ, дАМФ, дЦМФ и дАМФ, причем на 5′-кон- це данного олигонуклеотида находится остаток дТМФ, на 3′-кон- це — остаток дАМФ.

Изучение вытянутых нитей ДНК методом рентгеноструктурн˝о- го анализа выявило, что молекулы ДНК имеют пространственн˝ую

структуру в виде спирали, включающей более одной полинукл˝еотидной цепи, а методом кислотно-щелочного титрования было˝

показано, что нативная структура ДНК стабилизируется вод˝ород-

ными связями. Учитывая эти данные, а также основываясь на п˝ра-

вилах Чаргаффа, Д. Уотсон и Ф. Крик в 1953 г. разработали модел˝ь

строения ДНК.

Согласно модели Д. Уотсона и Ф. Крика молекула ДНК пред-

ставляет собой двойную правозакрученную спираль, состоя˝щую

из двух полинуклеотидных цепей, которые закручены между с˝о-

бой и вокруг общей оси. Эти цепи антипараллельны, поэтому н˝а

каждом из концов двойной спирали находится 5′-конец одной цепи и 3′-конец другой. Сахарофосфатные группировки, входя-

470