Биохимия растений

Рис. 12.2. Образование водородных связей между комплементар˝ными основаниями

âмолекулах ДНК:

À— аденин; Т — тимин; Г — гуанин; Ц — цитозин; R1 è R2 –комплементарные цепи двойной

спирали ДНК

ли две полинуклеотидные цепи. При этом между аденином и ти˝- мином возникают две водородные связи, а между гуанином и ц˝и- тозином — три (рис. 12.2).

Один виток спирали включает по 10 нуклеотидов в каждой из двух цепей, и его длина по оси спирали составляет 3,4 нм, а меж˝- нуклеотидные расстояния — 0,34 нм. Диаметр двойной спирал˝и

ДНК 1,8 нм. Плоскости оснований в двойной спирали ДНК перпендикулярны оси спирали, а соседние по направлению цепей˝ пары оснований находятся под углом 36°. Как было установлен˝о,

модель структуры ДНК Д. Уотсона и Ф. Крика отображает пространственное строение основной формы ДНК, в виде которой˝ она существует в клетках живых организмов. Ее назвали Â-ôîð- ìîé. Â Â-форме остаток дезоксирибозы имеет S-конформацию, а азотистые основания — àíòè-конформацию.

Однако в дальнейшем было выяснено, что молекула ДНК мо-

жет принимать и другую конформацию. Методом рентгеностру˝к-

турного анализа показано, что при понижении концентрации˝ воды или добавлении спирта в ДНК изменяется пространстве˝нная структура дезоксирибозы, которая принимает N-конформацию. В

результате перестройки структуры остатка дезоксирибозы˝ умень-

шаются расстояния между нуклеотидными остатками (до 0,25 нм˝), вследствие чего увеличивается диаметр двойной спирали, а˝ число нуклеотидных пар в одном витке спирали возрастает до 11. Одна-

ко спираль остается правозакрученной и конформация азот˝истых

оснований не изменяется. Двойную спираль, имеющую указанн˝ые параметры, называют À-формой ДНК. Между À- è Â-формами

ДНК существуют еще и переходные варианты пространственн˝ой структуры двойной спирали.

В ходе исследований выяснено, что некоторые участки двойн˝ой спирали ДНК под воздействием внешней среды могут переход˝ить из правозакрученной в левозакрученную форму, которая получила

471

ZB

Рис. 12.3. Пространственное изображение Â- è Z-формы ДНК (темными линиями соединены остатки фосфорной кислоты, отмеченные темными˝ кружками)

название Z-формы (рис. 12.3). Такой способностью обладают

участки молекулы ДНК, имеющие последовательность нуклео˝ти-

дов с повторяющимися парами оснований (—Г—Ц-)n. При увели- чении ионной силы раствора или добавлении спирта участки˝ двой-

ной спирали ДНК, включающие чередующиеся ГЦ-последовател˝ь-

ности, образуют левозакрученную Z-форму. Формирование Z-ôîð-

мы обусловлено тем, что под влиянием указанных выше услов˝ий

конформации нуклеотидных остатков в чередующихся ГЦ-пос˝ле-

довательностях попарно изменяются на противоположные: в˝ остатках дезоксицитидиловой кислоты дезоксирибоза имеет S-конфор-

мацию, а азотистое основание цитозин — àíòè-конформацию, тог-

да как в остатках дезоксигуаниловой кислоты дезоксирибо˝за принимает N-конформацию, а гуанин — ñèí-конформацию.

Возможность перехода двойной спирали ДНК в разные конформационные состояния показывает высокую лабильность ˝моле-

кул ДНК, которая необходима им для участия в довольно слож˝ных

биохимических процессах, связанных с передачей генетиче˝ской информации в ходе синтеза белков и размножения организмо˝в. Зависимость свойств двойной спирали ДНК от состава в ней ˝нуклеотидных пар подтверждается также температурой плавления ДНК. Процесс плавления ДНК — это одновременное разрушение ее двойной спирали и разъединение полинуклеотидных цепе˝й при

повышении температуры. При этом участки ДНК, преимуще-

ственно построенные из повторяющихся АТ-пар, плавятся при˝

более низкой температуре по сравнению с участками, включа˝ю-

472

щими повторяющиеся ГЦ-пары, вследствие чего плавление все˝й

молекулы ДНК происходит в определенном интервале темпер˝а- тур. Начало и конец плавления обычно различаются на 10...15 °С.˝ Различия по температурам плавления участков ДНК, состоящ˝их из АТ- и ГЦ-пар, объясняются тем, что между аденином и тимином в двойной спирали ДНК имеются две водородные связи, а между гуанином и цитозином — три.

При рассмотрении строения ДНК следует отметить, что под влиянием внешней среды молекула ДНК может переходить из о˝д-

ной конформации в другую, но ее нуклеотидный состав и посл˝е- довательность соединения нуклеотидов остаются неизменн˝ыми, что является важным условием сохранения генетической ин˝фор-

мации, которая заложена, как мы увидим далее, именно в виде последовательности нуклеотидных остатков.

Для сохранения стабильности молекул ДНК важное значение˝ имеет также принцип комплементарного связывания основа˝ний в

двойной спирали ДНК, в результате чего, зная последовател˝ь- ность соединения нуклеотидов в одной цепи, можно определи˝ть первичную структуру другой цепи, образующей с первой двойную

спираль. Так, например, если в одной из цепей двойной спира-˝ ли ДНК имеется последовательность нуклеотидных остатков —А—Г—Ц—Т—Ц—Г—, то совершенно очевидно, что в другой цепи согласно принципу комплементарности оснований образует˝ся последовательность —Т—Ц—Г—А—Г—Ц—. Указанная закономер-˝

ность в построении молекул ДНК предопределяет возможнос˝ть синтеза новых молекул ДНК с сохранением заданной последовательности нуклеотидов, что осуществляется при размножении

клеток организмов.

У высших организмов молекулы ДНК локализованы главным

образом в хромосомах клеточного ядра, по одной молекуле в˝ каждой хромосоме. Поскольку длина полинуклеотидной цепи ДНК˝ во много раз (≈10 тыс. раз) превышает линейные размеры хромо-

сом, она образует строго упорядоченные компактные структ˝уры,

которые принимают наименьшие линейные размеры в метафаз˝- ных хромосомах. Основные структурные единицы при упаковк˝е ДНК в хромосомах — нуклеосомы, которые формируются с участи-

ем гистоновых белков.

Нуклеосома представляет собой октамер, содержащий по две˝

молекулы каждого из четырех гистонов — Н2А, Н2В, Н3 и Н4, на который закручена двойная спираль ДНК длиной 150—200 пар нуклеотидов. Диаметр нуклеосомы 10 нм, толщина — 5,7 нм. Образование нуклеосомы происходит в результате взаимодей˝ствия положительно заряженных аминокислотных остатков гистон˝ов с

отрицательно заряженными фосфатными группировками нукл˝еотидов ДНК, а также взаимодействия между гидрофобными груп˝- пировками молекул гистонов, образующих гидрофобные глоб˝улы.

473

Между нуклеосомами находятся участки ДНК длиной 20— 90 пар нуклеотидов в виде двойной спирали. Под воздействием физиологической среды нуклеосомы, соединенные свободны˝ми участками двойной спирали ДНК, формируют микрофибриллы

диаметром 10 нм. Далее с участием гистонов Н1 и в присутствии˝ катионов Са2+ микрофибриллы диаметром 10 нм закручиваются в

левую суперспираль диаметром 30 нм и превращаются в крупн˝ые хроматиновые фибриллы, которые, взаимодействуя со структ˝ур-

ными белками хромосомы, образуют суперспирализованные п˝ет-

ли, называемые доменами, закрепленные в структуре хромосо˝мы в

строго определенном месте. В среднем в составе одного дом˝ена

обычно насчитывается 40—50 тыс. нуклеотидных пар, образующих группу функционально связанных генов. В опытах показа˝но,

что в упаковке хроматиновых фибрилл в составе метафазных˝ хро-

мосом принимают участие гистоны Н1.

Âклетках прокариот (низших организмов) двойные спирали

молекул ДНК образуют замкнутую кольцевую структуру, осно˝вой формирования которой служат белки негистоновой природы˝. Эта

структура получила название нуклеоида. В составе нуклеоида бел-

ки негистоновой природы образуют комплексы с молекулой Д˝НК,

переводя ее в высокоупорядоченное состояние.

У растений и других высших организмов не вся ДНК содержит˝- ся в хромосомах ядра, часть ее находится в виде кольцевых с˝трук-

тур в составе митохондрий и пластид. Митохондриальная и п˝лас-

тидная ДНК содержит генетическую информацию, необходиму˝ю

для осуществления этими органеллами клетки их биологиче˝ских

функций. Как и ДНК прокариот, кольцевые молекулы митохонд˝- риальной и пластидной ДНК при взаимодействии со специфич˝ескими белками образуют нуклеоиды.

12.2.ВИДЫ РНК И ИХ СТРОЕНИЕ

Âклетках организмов содержатся три вида РНК: рибосомная (рРНК), информационная, или матричная (мРНК), и транспортная (тРНК). Основная функция РНК — перенос генетической и˝н-

формации от ДНК на белки. Первые сведения об участии РНК в

синтезе белков были получены в 1941—1942 гг. Однако более полное представление о строении и функциях каждого из трех в˝идов РНК было достигнуто в 1956—1961 гг., когда были открыты рибо-

сомы и рибосомная РНК, а также выяснена биологическая рол˝ь

информационной и транспортной РНК.

Рибосомная РНК. Этот вид РНК локализован в составе рибосом

цитоплазмы и внутриклеточных органелл — митохондрий и ˝хло-

ропластов. Однако ее синтез происходит в ядре. У высших орг˝а-

474

низмов местом синтеза большей части рРНК является ядрышк˝о. Гены рРНК в хромосомах клеток представлены многими повто˝ряющимися копиями. Полинуклеотидные последовательности рРНК содержат информацию о структуре рибосомных белков,

многие из которых после их синтеза образуют с рРНК компле˝ксы и химические соединения в виде нуклеопротеидов. В количе-˝

ственном отношении рРНК преобладает в клетке над другими˝ видами РНК, на ее долю приходится до 90 % общего содержания

РНК в клетке.

Âклетках прокариот каждая рибосома содержит три молекул˝ы

рРНК, различающиеся по составу нуклеотидов и молекулярны˝м

массам. Большая по размерам субъединица рибосомы прокари˝от (50S-субъединица) содержит 23S-РНК, состоящую из 3300 нуклео-

тидных остатков, и 5S-РНК, включающую 120 нуклеотидных еди-

ниц. В малой субъединице находится 16S-РНК, в полинуклеотид-

ной цепи которой насчитывается 1700 нуклеотидных остатков.

Âцитоплазматических рибосомах высших организмов содер˝- жатся четыре вида РНК: 28S-РНК, имеющие в своем составе 5000

нуклеотидных остатков (н. о.); 18S-РНК (2000 н. о.), 5,8S-РНК

(150 н. о.) и 5S-РНК (120 н. о.). Гены, кодирующие структуру

28S-РНК, 18S-РНК и 5,8S-РНК, локализованы в ядрышке, а гене-

тическая информация о структуре 5S-РНК содержится в других˝ участках хромосом вне ядрышка. В большой субъединице цито˝-

плазматических рибосом высших организмов (60S-субъединица˝)

локализованы 28S-РНК, 5,8S-РНК и 5S-РНК, в малой субъедини-

це (40S-субъединица) — 18S-РНК. В хлоропластных рибосомах

содержатся такие же по размерам молекулы рРНК, как и в клет˝ках прокариот. Митохондриальные рРНК по размерам и структуре˝ также ближе к бактериальным.

Матричная РНК. Матричная, или информационная, РНК в отличие от рРНК является короткоживущей формой РНК. Период полужизни ее молекул у бактерий составляет в среднем 2—3 м˝ин, а

óвысших организмов — от нескольких часов до 1—2 ñóò. Îñíî˝âíàÿ

функция мРНК — копирование нуклеотидных последователь˝нос-

тей ДНК, кодирующих структуру определенных белковых поли˝- пептидов, и участие совместно с рибосомами и тРНК в синтез˝е белков. В клетках прокариот синтезируемая мРНК содержит нуклеотидные последовательности одного или нескольких ˝генов.

В клетках эукариот каждая молекула мРНК копирует структу˝ру

одного гена и обычно включает 1500—2000 нуклеотидных остатков. На ее 5′-конце находится радикал 7-метилгуанозина, а к 3′-концу присоединяется полинуклеотидная цепь, включающая около 100 по-

вторяющихся остатков адениловой кислоты (поли-А). Исключе˝-

ние составляют мРНК гистоновых белков. Радикал 7-метилгуа˝но-

зина соединяется с 5'-концом мРНК трифосфатной группиров-

475

кой, которая образует эфирные связи с остатками рибозы 7-ме˝- тилгуанозина и последующего остатка нуклеотида на 5′-конце полинуклеотидной цепи мРНК:

В клетках организмов количество мРНК обычно составляет 1—˝

3 % общей суммы РНК. По наличию в клетке тех или иных видов

мРНК можно судить об активности функционирования соотве˝т- ствующих генов, кодирующих структуру определенных белко˝в,

которые в данный момент обеспечивают жизнедеятельность˝ клет-

ки. Молекулы рибосомной и матричной РНК образуются из од-

ной полинуклеотидной цепи, которая на отдельных участках˝ фор-

мирует короткие двойные спирали. Между участками двойной˝ спирали в виде разной формы петель находятся участки одно˝це-

почечной РНК. Меньшие по размеру одноцепочечные фрагмент˝ы

в виде петель также довольно часто прерывают структуру дв˝ойных

спиралей РНК.

Образование двойных спиралей в молекулах РНК инициируют˝ водородные связи, возникающие между парами оснований А—У˝ и Г—Ц, а в отдельных случаях водородными связями скрепляютс˝я

также пары оснований Г—У. Цепи РНК, образующие двойные

спирали, антипараллельны и существуют в правозакрученно˝й А-форме, подобной А-форме молекул ДНК. За счет взаимодействия элементов вторичной структуры молекулы РНК формир˝у- ют довольно компактную и упорядоченную третичную структ˝у-

ру. Она стабилизируется образованием водородных связей м˝ежду

основаниями, входящими в состав одноцепочечных участков˝ в разных частях молекулы РНК, образуя с ними комплексы в виде двойной спирали.

Одноцепочечные участки могут взаимодействовать также с˝ ос-

нованиями в составе двойных спиралей РНК. Кроме того, воз-

можно образование водородных связей при взаимодействии НО-

групп рибозы с азотом оснований. Для стабилизации третичн˝ой структуры РНК важную роль играют также катионы Mg2+ и другие

476

двухвалентные катионы, которые связываются с фосфатными˝ остатками и отрицательно заряженными группировками основ˝аний полинуклеотидной цепи.

Транспортная РНК. Этот вид РНК находится в клетках организмов в растворимом состоянии в жидкой фазе и осуществляет ˝функцию избирательного связывания аминокислот и переноса их˝ к рибосомам, осуществляющим синтез белков. Для каждой амино˝-

кислоты имеются свои виды тРНК. Молекулы тРНК прокариот и высших организмов по размерам и структурным характеристикам существенно не различаются. Они образуют полинуклеот˝ид-

ную цепь, состоящую из 70—90 нуклеотидных остатков, которая имеет пространственную структуру в виде «клеверного лис˝та» (рис. 12.4).

В молекуле любой тРНК имеется четыре участка, образующих

двойные спирали за счет водородных связей между комплеме˝нтарными основаниями. Три таких участка заканчиваются одноце˝по- чечными петлями, включающими модифицированные нуклеоти˝-

ды, а четвертый участок содержит 3′- è 5′-концы полинуклеотидной цепи тРНК. На 3′-конце любой тРНК находится последовательность из трех нуклеотидных остатков Ц—Ц—А, служащая для связывания аминокислоты. На противоположном конце трети˝ч- ной структуры тРНК имеется одноцепочечная петля, содержа˝щая

в центральной ее части последовательность из трех нуклео˝тидных остатков, называемую антикодоном. Она комплементарна одному из кодонов мРНК и в ходе синтеза полипептидной цепи соеди˝ня-

ется водородными связями с этим кодоном мРНК, обеспечивая˝ таким образом включение в полипептид соответствующего а˝минокислотного остатка, связанного с данной тРНК. У каждой тРН˝К имеется свой антикодон.

Характерной особенностью тРНК является наличие в их

структуре большого количества модифицированных нуклеотидов.˝

Одной из распространенных форм модификации нуклеотидов является метилирование оснований или остатков рибозы по ги˝дроксильной группе у второго углеродного атома. В результате при-

соединения водорода к азотистым основаниям происходит образование дигидропроизводных различных нуклеотидов. Оста˝тки

уридиловой кислоты в ходе модификации превращаются в ост˝атки псевдоуридиловой кислоты, в которой рибоза соединяется н˝е с азотом, а с пятым углеродным атомом урацила:

477

Рис. 12.4. Схематическое изображение строения фенилаланино˝вой тРНК из дрожжей:

ψ — псевдоуридиловая кислота; Y — сверхмодифицированный˝ нуклеотид; НСО — метилиро-

3

вание рибозы; Н3С — метилирование азотистого основания; Н2—У — дигидроуридиловая кислота; Т — риботимидиловая кислота

Остаток псевдоуридиловой кислоты в полинуклеотидных це˝пях тРНК обозначают буквой ψ. Остаток урацила псевдоуридиловой кислоты, как и в составе уридиловой кислоты, образует комп˝ле-

ментарную пару с остатком аденина, входящего в состав аде˝ниловой кислоты. В антикодоновой петле тРНК к 5′-концу антикодона

всегда присоединяется остаток уридиловой кислоты (У), а со˝ стороны 3′-конца — остаток сильно модифицированного нуклеотида,

обозначаемого буквой Y. Этот нуклеотид образуется из гуан˝ило-

вой кислоты в результате модификации в ней азотистого осн˝ова-

478

ния гуанина. У некоторых тРНК в состав антикодонов наряду˝ с остатками типичных нуклеотидов входят также остатки ино˝зиновой кислоты.

12.3. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

Первые сведения о связи генов с биохимическими процессам˝и

в организмах были получены в начале 1900-х годов, когда у людей˝

выявили причины заболеваний, вызванных накоплением опре˝деленных биохимических продуктов. На основании этих данных˝

было сформулировано предположение, что в организме накоп˝ле-

ние биохимических продуктов, вызывающее наследственное˝ забо-

левание, связано с неспособностью организма синтезирова˝ть фер-

мент, катализирующий превращение определенного химического вещества, вследствие чего данное вещество накапливает˝ся и из

него не образуется необходимый для жизнедеятельности ор˝га-

низма продукт превращения. Все это приводит к очень серье˝з-

ным заболеваниям, многие из которых имеют летальный исход˝.

Указанные наследственные нарушения биохимических превр˝а- щений в организме стали называть врожденными ошибками метаболизма.

Âдальнейшем подобные ошибки метаболизма были изучены

óразличных мутантных генотипов, которые под воздействие˝м му-

тагенных факторов теряли способность к синтезу определе˝нных ферментов, катализирующих образование соответствующих био-

химических продуктов. Для выживания полученных биохимич˝ес-

ких мутантов требовалось добавление в питательную среду˝ соот-

ветствующего метаболита, образующегося в клетках органи˝зма под действием фермента, способность к синтезу которого была утрачена в результате мутации. Окончательные выводы по ре˝- зультатам этих исследований сформулировали в 1941 г. Д. Бидл˝ и

Э. Тейтем, которые наблюдали биохимические отклонения у м˝у-

тантов нейроспоры (N. ñrassa), индуцируемых рентгеновским излучением.

Под действием рентгеновских лучей у мутантных форм блоки˝- ровался синтез одного из жизненно важных метаболитов в св˝язи с

отсутствием нужного фермента, который у нормальных генот˝ипов

функционирует. Таким образом, было отмечено, что в результ˝ате мутации теряется способность к синтезу определенного фе˝рмента, под действием которого образуется нужный метаболит. Поэт˝ому

для обеспечения жизнедеятельности полученного мутанта ˝данный

метаболит необходимо добавлять в питательную среду. Из эт˝их опытов Д. Бидлу и Э. Тейтему стало ясно, что синтез фермент˝ов в

клетках организмов связан с активностью соответствующи˝х генов,

и они сформулировали гипотезу «один ген — один фермент»˝. Со-

479

гласно этой гипотезе синтез каждого фермента в организме˝ осуществляется под контролем определенного гена.

Гипотеза «один ген — один фермент» дала ключ к пониманию˝

молекулярного механизма генетических процессов и возмо˝жность предположить, как гены влияют на формирование признаков у˝ живых организмов. Под контролем генов осуществляется синтез

ферментов, которые катализируют образование соответств˝ующих

метаболитов, а с участием этих метаболитов уже происходит˝ направленное формирование тех или иных признаков организм˝а.

Однако после открытия четвертичной структуры белков ста˝ло оче-

видно, что большинство белковых молекул (включая и молеку˝лы ферментов) состоят из нескольких полипептидов, каждый из˝ ко-

торых имеет определенную первичную структуру и кодирует˝ся

своим структурным геном. Поэтому гипотеза «один ген — од˝ин фермент» подверглась уточнению, и теперь она формулирует˝ся

«один ген — одна полипептидная цепь».

Изучение строения однотипных белковых молекул у нормаль˝- ных и мутантных форм организмов позволило получить допол˝ни-

тельные сведения о характере связи между генами и белками˝. В

1957 г. В. Ингрэм установил, что мутантная форма гемоглобина˝ человека у больных серповидно-клеточной анемией отличае˝тся от

нормального гемоглобина по первичной структуре β-öåïè. Ó íîð-

мального гемоглобина шестое положение от N-конца β-цепи занимает остаток глутаминовой кислоты, а у серповидно-клето˝чно-

го — остаток валина. Таким образом, было показано, что ген˝ети-

ческое отклонение, вызывающее серповидно-клеточную анем˝ию, связано с изменением аминокислотного состава белка — г˝емогло-

бина. В ходе опытов исследователи пришли к пониманию, что именно гены определяют первичную структуру белков, т. е. ˝последовательность соединения аминокислотных остатков в пол˝ипептидах, из которых образуются белковые молекулы.

Одновременно с выяснением действия генов на аминокислот˝- ный состав белков проводилось изучение структуры генов. После того как в 1944 г. была установлена генетическая функция ДНК, связанная с хранением наследственных свойств организма˝, биохимикам стало ясно, что каждый ген представляет собой часть˝ молекулы ДНК, которая состоит из определенной последовательн˝ости нуклеотидных остатков, соединенных фосфодиэфирными свя˝зями. Сопоставление генетических карт мутаций генов, опреде˝ляю-

щих полипептидные последовательности белков, показало, ч˝то

мутации, вызывающие аминокислотные изменения в конце пол˝и-

пептидной цепи, размещаются на генетической карте хромос˝омы дальше от ее начала, чем аналогичные мутации, изменяющие ами-

нокислотные остатки в начале полипептидной цепи.

480