Биохимия растений

Такие белки получили название SSB-белков (от английского single strand binding proteins). SSB-белки, вплотную прилегая друг к другу, связывают одноцепочечные участки ДНК и делают их боле˝е реакционно-способными для взаимодействия с ферментом ДН˝К-

полимеразой.

Âрезультате расплетания хеликазой двойной спирали ДНК

возникает ее вращательное движение впереди репликативн˝ой вилки. Однако в связи с тем, что хромосома связана и закреплена˝ кле-

точными мембранами, вращение двуспиральной ДНК приводит˝ к

образованию дополнительных витков и сверхскрученных уз˝лов на

пути продвижения репликативной вилки, что могло бы в даль˝ней-

шем остановить процесс репликации ДНК. Но этого не происх˝о- дит вследствие того, что на участке сверхспирализации впе˝реди по

движению репликативной вилки действует фермент топоизомераза, образующий разрыв фосфоэфирной связи в одной из цепей

двуспиральной ДНК. За счет такого действия топоизомеразы˝

обеспечивается свободное вращение оставшейся неразорва˝нной одноцепочечной нити ДНК вокруг ее σ-связи, что приводит к

снятию сверхспирализации ДНК на участке продвижения реп˝ли-

кативной вилки и раскручиванию образовавшихся узлов, выз˝ван-

ных действием фермента хеликазы. После раскручивания доп˝ол-

нительных витков сверхспирализации топоизомераза восст˝анавливает разорванную фосфодиэфирную связь и таким образом˝ со-

храняет структурную целостность двойной спирали ДНК, кот˝орая

участвует в процессе репликации.

Âклетках бактерий обнаружена разновидность топоизомер˝аз,

называемых ДНК-гиразами, которые реализуют другой механизм снятия сверхспирализации двойной спирали ДНК при ее репл˝и- кации. Эти ферменты сами создают сверхвитки спирали впере˝ди

репликативной вилки, но закручивают их в противоположном˝ направлении по отношению к той сверхспирализации ДНК, котор˝ая возникает в результате действия фермента хеликазы. Поэто˝му отрицательная сверхспирализация ДНК, создаваемая ДНК-гира˝зой,

способствует раскручиванию двойной спирали ДНК в реплик˝а-

тивной вилке. Кроме того, ДНК-гираза способна образовыват˝ь временные двухцепочечные разрывы кольцевых молекул ДНК˝ бактерий для их разъединения после осуществления процес˝са репликации. На создание отрицательных витков ферментом ДНК-г˝и-

разой затрачивается энергия, которая высвобождается в ре˝зультате

гидролиза АТФ.

Действие ферментов топоизомераз является также очень ва˝ж- ным фактором в инициации процесса репликации ДНК, так как˝

инициаторные белки способны взаимодействовать с ori-участком

ДНК только в том случае, когда этот участок имеет определе˝нную

степень сверхспирализации. Но с такими сверхспирализова˝нными

491

участками ДНК активно взаимодействуют молекулы РНК, обра˝- зуя гибридные ДНК — РНК-участки, к которым уже не может присоединиться инициирующий репликацию ДНК белок. Гидро˝- лиз РНК в составе гибридных ДНК — РНК-участков катализирует

фермент РНКаза Í, обеспечивающий таким образом подготовку ori-участка ДНК для присоединения к нему инициаторного белка˝

èбелкового комплекса хеликазы.

Âрезультате действия хеликазы и SSB-белков образуются две

разъединенные цепи ДНК, имеющие противоположную направ-

ленность. Одна из них начинается от 3′-конца, другая — от 5′-êîí-

ца. На цепи ДНК, начинающейся с 3′-конца, после образования

РНК-затравки возможен непрерывный синтез новой цепи ДНК

под действием фермента ДНК-полимеразы, способного присое˝-

динять к 3′-ОН растущей цепи новые нуклеотидные остатки. Од-

нако на цепи ДНК, начинающейся с 5′-конца, такой синтез новой

цепи ДНК невозможен. Он должен происходить в обратном на-

правлении после образования одноцепочечного участка ДН˝К оп-

ределенной длины, вследствие чего синтез ДНК на одноцепоч˝еч-

ной ветви репликативной вилки, начинающейся с 5′-конца, про-

исходит медленнее, чем на другой одноцепочечной ветви, на˝чина-

ющейся с 3′-конца. В связи с этим одну из синтезирующихся

цепей ДНК называют ведущей, а другую цепь, синтез которой происходит медленнее, — отстающей.

Âопытах Р. Оказаки было показано, что отстающая цепь ДНК

синтезируется в виде коротких фрагментов, называемых фрагментами Оказаки. Каждый такой фрагмент начинается с синтеза

РНК-затравки с участием ДНК-праймазы, а далее действует фе˝р- мент ДНК-полимераза III (у бактерий) или ДНК-полимераза α (у высших организмов), который уже синтезирует ДНК-цепь фраг˝-

мента Оказаки, доводя ее до следующей РНК-затравки. После

этого в действие включается фермент ДНК-полимераза, облад˝ающая 5′-экзонуклеазной активностью (у бактерий это ДНК-полиме- раза I), которая удаляет впереди себя РНК-затравку и вместо˝ нее

достраивает цепь ДНК до следующего фрагмента Оказаки. На ˝сты-

ке двух фрагментов Оказаки имеется с одной стороны 3′-ОН, а с другой 5′-фосфатная группа, между которыми под действием фермента ДНК-лигазы образуется фосфодиэфирная связь, соедин˝яющая фрагменты Оказаки в единую синтезируемую цепь ДНК.

Âходе образования фосфодиэфирной связи между фрагмента˝-

ми Оказаки с участием ДНК-лигазы происходит вначале актив˝а- ция 5′-фосфатного остатка путем присоединения к нему остатка

адениловой кислоты от НАД или АТФ, а затем взаимодействие˝

активированного 5′-фосфатного остатка одного фрагмента Оказа-

êè ñ 3′-ОН другого, которое заканчивается синтезом фосфоди-

эфирной связи и высвобождением аденозинмонофосфата:

492

Линейные размеры фрагментов Оказаки зависят от вида орга˝-

низмов; у бактерий они составляют в длину до 1000 нуклеотидны˝х

остатков, у высших организмов — около 100.

Наиболее хорошо процесс репликации ДНК изучен у бактерий˝

Å. cîli. В клетках E. coli формирование репликативной вилки инициируют два вида хеликаз. Одна из них образует комплекс с ф˝ер-

ментным белком праймазы, который получил название праймосомы. Расплетая двухцепочечную ДНК, этот комплекс движется по˝ отстающей ее цепи в направлении от 5′-конца к 3′-концу и синтезирует на этой цепи РНК-затравки для фрагментов Оказаки. Вто-

рая хеликаза (вспомогательная) движется по ведущей цепи Д˝НК от

åå 3′-конца к 5'-концу. Впереди по движению репликативной вилки действует фермент ДНК-гираза, снимающий витки сверхспира˝ли-

зации двойной спирали ДНК, которые возникают в результате˝ работы хеликаз. Образовавшиеся в репликативной вилке одноц˝епо- чечные участки ДНК связываются SSB-белками и сразу же становятся объектами действия для фермента ДНК-полимеразы III.

Одна молекула ДНК-полимеразы III движется по одной из ветвей репликативной вилки и синтезирует ведущую цепь ДНК. Д˝ру-

гая молекула этого же фермента движется по другой одноцеп˝очеч-

ной ветви и катализирует образование фрагментов Оказаки˝, достраивая полинуклеотидные участки от одной затравки до дру˝гой. После этого фермент ДНК-полимераза I удаляет РНК-затравки˝ и вместо них достраивает фрагменты Оказаки нуклеотидными˝ остатками ДНК. На конечном этапе синтеза отстающей полинукл˝е- отидной цепи ДНК фермент ДНК-лигаза соединяет фрагменты Оказаки фосфодиэфирными связями в единую цепь.

В основных чертах механизм репликации ДНК у разных организмов имеет много общего, хотя у высших организмов по сра˝в- нению с низшими имеются определенные особенности. Многие˝

из них уже рассмотрены в данной главе. Следует добавить ещ˝е одно отличие механизма репликации ДНК у высших организмо˝в

493

по сравнению с низшими. Оно связано со строением хромосом˝. У высших организмов хромосомы линейны и у них на 5′-конце отстающей цепи ДНК остается недореплицированный участок в˝ связи с неспособностью ДНК-полимераз инициировать синте˝з

ДНК на одноцепочечной матрице. Для того чтобы репликация ДНК проходила полностью, у высших организмов имеются удли˝-

нения на концах хромосом из повторяющихся последователь˝ностей нуклеотидов, которые образуют изгиб с разворотом цепи˝ на

180°, так что свободных концов у хромосомы фактически нет.

Присоединение к концам хромосом повторяющихся последов˝а-

тельностей нуклеотидов катализирует специальная трансфераза.

Длина концевых фрагментов хромосом контролируется регу˝ляторной системой клетки.

Необходимо отметить, что репликация ДНК — энергоемкий

процесс, который во время своего осуществления вызывает а˝кти-

визацию биоэнергетических превращений, сопряженных с си˝н-

тезом АТФ и других макроэргических соединений. Энергия АТ˝Ф затрачивается на новообразование дезоксирибонуклеозид˝три-

фосфатов, участвующих в синтезе полинуклеотидных цепей

ДНК; рибонуклеозидтрифосфатов, участвующих в синтезе РНК˝-

затравок; на работу хеликаз и топоизомераз, а также активацию

ДНК-полимераз, которая происходит при переходе этого фер-˝ мента на каждый из фрагментов Оказаки при синтезе отстающ˝ей

öåïè ÄÍÊ.

Как было указано ранее, репликация ДНК в клетках организм˝ов

осуществляется с очень высокой точностью, однако с неболь˝шой

частотой ошибки все-таки происходят, и в структуру новоси˝нтезируемой цепи ДНК включаются нуклеотидные остатки, которые˝ некомплементарны матрице. Такие ошибки репликации исправл˝яют

ферменты, относящиеся к системе репарации ДНК. Процесс ре˝парации ДНК — это исправление ошибок репликации ДНК и устр˝а- нение измененных нуклеотидных остатков, которые возника˝ют под воздействием мутагенных факторов — радиации, ультрафио˝летово-

го излучения, алкилирующих химических веществ, дезаминир˝ова-

ния и потери оснований в нуклеотидных остатках.

В систему репарации ДНК входят ферменты, способные расщеплять или восстанавливать межнуклеотидные фосфодиэфи˝р- ные связи, удалять измененные неправильно присоединенны˝е

нуклеотидные остатки и присоединять вместо них правильн˝ые

нуклеотидные остатки, которые комплементарны матричной˝ цепи ДНК. На репарационные процессы затрачивается значи- тельное количество энергии, которая обеспечивается за сч˝ет гид-

ролиза АТФ.

Чтобы система репарации ДНК работала правильно, ей необ-

ходимо распознавать матричную цепь ДНК и отличать ее от н˝о-

494

восинтезированной цепи, в которой при репликации могут по˝- явиться ошибки. В ходе экспериментов было определено, что˝ че-

рез несколько минут после репликации новосинтезированн˝ая

ДНК подвергается метилированию под действием специфиче˝ских метилаз, которые присоединяют метильный радикал к аденин˝о- вым остаткам в последовательностях нуклеотидов Г—А—Т—Ц˝.

Перед репликацией такие последовательности оказываются˝ мети-

лированными в обеих цепях ДНК. После репликации в течение˝ нескольких минут новая цепь ДНК оказывается без метильны˝х

радикалов, тогда как матричная цепь метилирована и эту це˝пь

распознают ферменты репарации ДНК. Используя ее как «пра-˝ вильную» нуклеотидную последовательность, они восстанавлива-

ют по ней поврежденные участки новосинтезированной цепи˝,

присоединяя в заданной последовательности комплементарные матрице нуклеотидные остатки.

Функционирование системы репарации ДНК обеспечивает ис˝-

ключение из ее структуры неправильно присоединенных или˝ измененных под действием мутагенных факторов нуклеотидны˝х ос-

татков и таким образом устойчиво поддерживает стабильно˝сть со-

держащейся в молекулах ДНК генетической информации. Одна˝ко с небольшой частотой иногда такие ошибки возникают и дают˝ на-

чало при репликации измененным молекулам ДНК. Появление в˝

результате ошибок репликации или действия мутагенных фа˝кторов молекул ДНК с измененным составом нуклеотидных остат˝ков

получило название генетических мутаций.

12.5.CИНТЕЗ РНК

Âклетках организмов синтез рибосомной, матричной и транс˝- портной РНК представляет собой первый этап внутриклеточ˝ной реализации генетической информации, закодированной в мо˝лекулах ДНК, он получил название транскрипции. В ходе этого процесса под действием ферментов РНК-полимераз осуществляе˝тся копирование определенных участков нуклеотидных последо˝вательностей ДНК в виде синтезируемых рибонуклеотидных це˝пей РНК, которые комплементарны ДНК-матрице. При синтезе РНК

принцип комплементарности оснований реализуется путем спаривания аденина с урацилом (А → У) и гуанина с цитозином (Г → Ö).

Âкачестве матрицы для синтеза РНК служит одна из цепей дву-

спиральной ДНК, которую называют значащей цепью.

Построение полинуклеотидной цепи РНК происходит в результате присоединения к свободным 3′-концам синтезирующей-

ся молекулы РНК 5′-фосфатных групп комплементарных ДНК-

495

матрице остатков рибонуклеотидов, источниками которых в процессе синтеза служат соответствующие рибонуклеозидтриф˝осфаты. В ходе реакции происходит гидролиз макроэргической св˝язи рибонуклеозидтрифосфата, присоединение рибонуклеотидн˝ого остатка к 3′-ОН синтезируемой молекулы РНК и высвобождение

свободного пирофосфата — Н4Ð2Î7. При этом у первого нуклеотидного остатка синтезированной цепи РНК на 5′-конце остается

трифосфатная группировка. Чаще всего инициаторными рибо˝-

нуклеозидтрифосфатами при синтезе РНК служат АТФ или ГТФ˝, с 3′-ОН которых далее взаимодействует следующий рибонуклео-

зидтрифосфат. Образование фосфодиэфирных связей в ходе син-

теза РНК можно представить в виде следующей схемы:

496

Синтез РНК начинается с того, что фермент РНК-полимераза присоединяется к определенному участку значащей цепи ДН˝К, называемому промотором, и, перемещаясь по этой цепи, катализирует образование на ДНК-матрице полирибонуклеотидной˝

цепи РНК. Синтез РНК заканчивается на участке ДНК, называе˝- мом терминаторным. Нуклеотидная последовательность ДНК, на-

чинающаяся промотором и заканчивающаяся терминатором, я˝в- ляется структурной единицей транскрипции и получила наз˝вание

транскриптона. У бактерий транскриптоны называют оперонами.

Они обычно включают по нескольку генов, которые кодируют

функционально связанные полипептиды. У высших организмо˝в

транскриптоны, как правило, включают по одному гену. Бактериальные РНК-полимеразы построены из двух белковых˝

компонентов: основного фермента, включающего каталитиче˝ские

центры для синтеза РНК, и σ-субъединицы, обеспечивающей пра-

вильное присоединение РНК-полимеразы к промотору и отдел˝я-

ющейся от основного фермента после начала синтеза РНК. Ос˝- новной компонент РНК-полимеразы состоит из двух α-субъеди-

ниц с молекулярными массами 36,5 тыс., β-субъединицы с моле-

кулярной массой 150,6 тыс. и β′-субъединицы с молекулярной

массой 155,2 тыс.

Размер σ-субъединицы варьирует у разных бактерий. Синтез генов рибосомных, транспортных и большинства матричных Р˝НК

катализируют РНК-полимеразы, включающие главную σ-субъеди-

ницу (молекулярная масса у Å. coli ≈ 70 тыс.). Однако для транс-

крипции некоторых генов используются так называемые минорные

σ-субъединицы, которые по размеру меньше главной σ-субъедини- цы и содержатся в клетках в значительно меньшем количеств˝е.

В ядрах клеток высших организмов найдены три вида РНК-по-

лимераз — I, II и III. РНК-полимераза I катализирует синтез в ядрышке 18S и 28S рибосомной РНК, РНК-полимераза II — синтез мРНК, РНК-полимераза III — синтез тРНК и других низкомолекулярных форм РНК. В каждой молекуле ядерных РНК-полиме-

раз содержатся две большие субъединицы с молекулярными м˝ас-

сами 120—220 тыс. и 5—13 малых субъединиц с молекулярными массами 10—100 тыс. Кроме того, в клетках высших организмов синтезируются хлоропластные и митохондриальные РНК-пол˝и- меразы. По строению хлоропластные РНК-полимеразы сходны с˝

аналогичными ферментами бактерий. Митохондриальные РНК˝-

полимеразы отличаются по строению и от ядерных, и от бакте˝риальных РНК-полимераз, но они имеют значительное сходство ˝с РНК-полимеразами некоторых бактериофагов.

Минорные σ-субъединицы РНК-полимераз инициируют син-

тез РНК не с основных промоторов, узнавание которых ферме˝н-

том происходит в результате присоединения главной σ-субъеди-

497

ницы, а с дополнительных, дающих начало транскрипции опре˝деленных генов, активируемых, как правило, под воздействием˝ фак-

торов окружающей среды. Так, например, у бактерий Å. coli äî-

полнительная σ-субъединица РНК-полимеразы с молекулярной массой 32 тыс. включает транскрипцию генов, активируемых те˝п- ловым шоком. У бактерий-азотфиксаторов транскрипция гено˝в,

кодирующих глутаминсинтетазу, и ферментов азотфиксации˝ ини-

циируется с участием специальной σ-субъединицы с молекулярной массой 60 тыс. Промоторы для начала транскрипции генов с˝

участием минорных σ-субъединиц отличаются по нуклеотидной

последовательности от участков ДНК, занимаемых главными˝ промоторами.

Процесс транскрипции начинается с присоединения фермен˝та

РНК-полимеразы к промотору, который представляет собой уч˝асток двуспиральной ДНК в самом начале транскриптона. Разме˝р

промотора определяется размером молекулы РНК-полимераз˝ы и у

бактерий обычно составляет по длине 70—75 нуклеотидных оста˝т- ков. Присоединяясь к промотору, РНК-полимераза образует к˝ом-

плекс с ДНК, в котором под действием ферментного белка про˝ис-

ходит расплетание одного витка двойной спирали ДНК в той ˝части промотора, где находится инициаторный нуклеотидный ос˝та-

ток, дающий начало синтезу рибонуклеотидной цепи РНК. К

инициаторному нуклеотидному остатку ДНК комплементарно˝ присоединяется молекула АТФ или ГТФ и далее уже к их 3′-ÎÍ

присоединяется следующий нуклеотидный остаток синтезир˝уе-

ìîé öåïè ÐÍÊ.

Инициаторный нуклеотидный остаток ДНК, дающий начало

транскрипции, находится в составе промотора на расстояни˝и примерно 20—25 нуклеотидных остатков от его границы, направлен-˝ ной по ходу транскрипции. В каждом промоторе содержится о˝п- ределенный набор участков со специфическими последоват˝ельностями нуклеотидных остатков, который «узнают» ферменты Р˝НКполимеразы, и только тогда они образуют с промоторами достаточно прочные комплексы, способные к инициации тран˝с- крипции.

В промоторах бактерий имеется два таких участка, узнаваем˝ых РНК-полимеразой. Один из них находится на расстоянии 10 нук-˝ леотидных остатков от инициаторного нуклеотида (с которо˝го на- чинается транскрипция) в направлении, противоположном на˝-

правлению транскрипции, он включает последовательность˝ нук-

леотидных остатков ТАТААТ, считая по незначащей цепи ДНК ˝в

направлении 5′ → 3′ (направление транскрипции). Второй участок удален от инициаторного нуклеотида на 35 нуклеотидных ост˝ат-

ков в том же направлении, что и первый участок, и содержит н˝ук-

498

леотидную последовательность ТТГАЦА в незначащей цепи Д˝НК.

Âпромоторах высших организмов, образующих активный комплекс с РНК-полимеразой III, имеется АТ-богатый участок на

расстоянии 20—30 нуклеотидных остатков, предшествующий в

цепи ДНК инициаторному нуклеотиду (по направлению транс-˝

крипции), его называют ТАТА-последовательностью. Наличие˝

указанных специфических нуклеотидных последовательнос˝тей в

составе промоторов позволяет соответствующей РНК-полимеразе

занять правильное место на промоторе и начать транскрипц˝ию с инициаторного нуклеотида и таким образом обеспечить нач˝ало

транскрипции с определенной стартовой точки и в правильн˝ом

направлении.

Стадия инициации транскрипции заканчивается при образо˝ва-

нии зачатка нуклеотидной цепи РНК длиной до трех—шести ну˝к- леотидных остатков (в зависимости от типа промотора), кото˝рый

образует со значащей цепью ДНК гибридную спираль и таким ˝об-

разом достаточно прочно удерживается в комплексе фермента с

ДНК. Как только заканчивается стадия инициации транскрип˝ции,

óбактерий от фермента РНК-полимеразы отделяется σ-субъедини- ца и процесс транскрипции переходит в следующую стадию —˝ ста-

дию элонгации синтезирующейся цепи РНК.

Âходе синтеза РНК-полимераза движется по матрице в на-

правлении от 3′-конца к 5′-концу значащей цепи ДНК, распле-

тая двойную спираль. В активном центре фермента осуществл˝яется присоединение нуклеотидов к растущей цепи РНК и удержи˝ва-

ется гибридный участок двойной спирали ДНК—РНК длиной

примерно 12 нуклеотидных остатков. Позади фермента восста˝нав-

ливается двойная спираль ДНК и одновременно из каталитич˝еского центра фермента высвобождается участок синтезируе˝мой цепи РНК (рис. 12.7).

На скорость движения РНК-полимеразы по ДНК-матрице ока-

зывает влияние степень спирализации ДНК. При увеличении о˝т-

рицательной сверхспирализации ДНК скорость движения РН˝К- полимеразы по матрице и, следовательно, скорость синтеза ˝РНК возрастает, так как в этом случае облегчается процесс рас˝плетания ДНК.

499

У бактерий синтез РНК заканчивается при достижении РНК-

полимеразой участка ДНК, называемого терминатором. В нем ˝со-

держится ГЦ-богатая последовательность, вслед за которой в зна-

чащей нити ДНК по ходу транскрипции следует последовател˝ь-

ность из четырех—восьми повторяющихся остатков аденило˝вой кислоты (поли-А). Транскрипция прекращается на конце участ˝ка поли-А или сразу же за ним. В результате транскрибирования˝ уча-

стка ДНК с повторяющимися ГЦ-парами нуклеотидов синтезир˝у- ется последовательность нуклеотидов РНК, обладающая спо˝собностью к формированию двойной спирали в форме шпильки, ко˝- торая разрушает большую часть гибридной двойной спирали˝ ДНК—РНК, что ослабляет связь синтезированной цепи РНК с ДНК-матрицей и приводит к высвобождению РНК из ферментно-˝

го комплекса РНК-полимеразы (рис. 12.8). После этого происходит отделение и самого фермента РНК-полимеразы от ДНК-мат˝- рицы. После соединения с σ-субъединицей ферментная молекула может снова взаимодействовать с промотором и катализиро˝вать синтез новой молекулы РНК.

Многие бактериальные терминаторы способны прекращать транскрипцию только в присутствии специального белково˝го фактора терминации, называемого ρ-фактором, который присоединяется к определенному участку РНК до того, как молекул˝а

фермента РНК-полимеразы доходит до терминатора. Белок ρ-фак- тора образует гексамер, который связывается с участком РН˝К длиной 80—90 нуклеотидных остатков и обеспечивает терминацию транскрипции при достижении РНК-полимеразой терминатор˝ного участка. В момент терминации происходит конформационн˝ое изменение ρ-фактора, которое приводит к вытеснению из ферментного комплекса РНК-полимеразы синтезированной цепи˝ РНК.

Изучение процесса терминации транскрипции генов у высших организмов с участием РНК-полимеразы II показало, что на

3′-концах синтезируемых полинуклеотидных цепей мРНК имеет˝-

ся специфическая последовательность ААУААА, которая пре˝д-

500