"Активный" подход или молекулярная биология и будущее генной инженерии

Будущее генной инженерии опирается на следующие достижения молекулярной биологии:

1) мутагенную активность определенных химических соединений. Ее можно использовать для того, чтобы вызвать специфические мутации в определенных генных локусах;

2) перенос генетической информации микроорганизмов неполовым путем (трансформация или трансдукция). Аналогичные попытки можно предпринять для эукариот, включая человека;

3) замену дефектных генов при использовании вирусных генов в качестве переносчиков;

4) включение искусственно синтезированных генов в геном человека.

Работа генного инженера складывается из трех этапов:

I Получение генетического материала — генов путем:

а) химического синтеза;

б) вырезания из ДНК;

в) ревертированного синтеза.

II. Введение в клетку реципиента полученных генов. Для этого используются векторы—проводники, которые чаще всего представлены плазмидами. Это ДНК-бактерии, имеющие меньшую молекулярную массу, чем хромосомные ДНК (1—2(109Д); 1(108Д). Эти ДНК претерпевают следующие изменения: ДНК из линейной формы превращаются в циркулярно замкнутую, далее — суперспираль. Процесс этой конформации обратим. Благодаря этой возможности плазмиды обладают трансмиссибельностью. В линейной форме, проникая в клетку реципиента, они "ввозят" подшитый к концу молекулы ген.

III. Включение генов в генетический аппарат клетки-реципиента, закрепление в ней и функционирование. Плазмиды способны встраиваться в геном клетки, а вместе с ними встраиваются и подшитые гены.

Успех генной инженерии — это комплексный успех всех трех этапов.

В литературе имеются сообщения о трансформации и трансдукции у эукариот. Такие примеры есть как для растений, так и для культивируемых клеток животных. В некоторых случаях удавалось достигнуть экспрессии генов прокариот в клетках эукариот. ДНК прокариот в большинстве случаев принадлежала вирусам, но иногда была и бактериального происхождения. Наиболее известный пример — перенос и экспрессия Gal-оперона Е. coli в фибробласты человека, осуществленные в 1971 г. У человека галактоза метаболизируется так же, как у Е. coli, и известны мутации, связанные с недостаточностью каждого из трех участвующих в метаболизме ферментов. Самой распространенной является галактоземия, обусловленная дефектом P-gal-уридилтрансферазы. Инкубация таких клеток in vitro с (-фагами, несущими Gal-оперон Е. coli), приводила к образованию трансферазы в этих клетках.

Однако попытки воспроизвести этот результат в последующие годы оказались неудачными. Лишь разработка новых методов встраивания ДНК позволила сильно продвинуться в этом направлении. Теперь можно считать, что практическое применение переноса генов для генной терапии соматических заболеваний вполне реально.

Искусственные гены

Синтез генов in vitro представляет собой одну из самых захватывающих страниц в истории молекулярной биологии. Группа Кораны синтезировала ген т-РНК для аланина. Точная последовательность нуклеотидов была известна заранее, ген синтезирован чисто химическим путем, начиная с отдельных фрагментов. Через несколько лет после того, как ген был синтезирован, группе Кораны удалось заставить его работать в синтезе т-РНК. Следовательно, был создан не только сам ген, но и все соседние области, необходимые для его активации.

До недавних пор создание искусственного гена химическими методами было очень трудным делом. В настоящее время синтез искусственных олигонуклеотидов вполне обычен. Таким образом, технология для конструирования искусственных человеческих генов у ученых в руках, и можно считать вполне реальным в будущем синтез генов с любой желаемой последовательностью нуклеотидов и информационным содержанием. С помощью упоминавшихся выше ферментов-рестриктаз такие гены можно затем встраивать в любой геном.