Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Фармакологическая оценка и использование лекарственных средств на основе производных ароксиалканкарбоновых кислот в ветеринарии и животноводстве. Моно
.pdf
следования. В комплекс лечения включали гинодиксин
в дозе 100 мл, который вводили внутриматочно до выздоровления. Оценку про- и антиоксидантной активности
сыворотки крови проводили до и через 5 сут после лечения гинодиксином. Кровь брали из яремной вены и получали общепринятым способом сыворотку.
Исследования прооксидантной активности (ПОА)
проводили по методу Д. Н. Маянского и др. (1996); антиоксидантной активности (АОА) сыворотки крови – хемилюминесцентым методом по методике Г. И. Клебанова
и др. (1999). Для изучения взаимодействия про- и антиоксидантной систем рассчитывали коэффициент их соотношения (КС) по следующей формуле: КС = ПОА / АОА.
Для установления дозозависимого эффекта действия гинодиксин тестировали in vitro. Для оценки ПОА и АОА
гинодиксина в кюветы для хемилюминесцентного анализа (вместо сыворотки крови) добавляли препарат в следующих концентрациях: 100, 75, 50, 25 и 10 %.
Исследования прооксидантной (ПОА) и антикосидантной активности (АОА) сыворотки крови проводили с помощью биохемилюминометра «СКИФ-0306М» (НПО «Наука», Красноярск) на базе лаборатории патофизиологии ГУ
Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (г. Новосибирск) совместно с М. Н. Скомаровой, Д.Д Цырендоржиевым, В. В. Курилиным.
Результаты оценки ПОА сыворотки крови коров на
разных сроках стельности представлены в табл. 20. В контрольной группе коров показатель ПОА сыворотки крови
варьировал от 210,3 до 345,7 отн. ед. и в среднем составил 278,3 ± 14,2 отн. ед. ПОА сыворотки крови на разных
сроках стельности неуклонно снижалась. Так, на сроке
стельности 8–30 дней показатель ПОА сыворотки крови
снизился в 2,76 раза, а через 2–3,5 и 5–7,5 мес – соответственно в 3,56 и 3,6 раза (Р < 0,001).
101
Одномоментно со снижением ПОА падала АОА сыворотки крови. Так, если среднее значение АОА сыворотки
контрольных животных составляло 33,4 ± 2,15 отн. ед., то
в динамике у стельных коров показатели АОА значительно снижались: на сроке стельности 8–30 дней – в 19,1
раза, а через 2–3,5 и 5–7,5 мес. – соответственно в 29,3
и 15,9 раза (Р < 0,001).
Среднее значение коэффициента соотношения (КС)
ПОА/АОА в сыворотке коров контрольной группы составило 8,3 ± 1,12 отн.ед. При этом на разных сроках стельности выявлено повышение данного показателя: на 8–30-е
сутки КС вырос в 6,7 раза, а через 2–3,5 и 5–7,5 мес – соответственно в 9,3 и 6,4 раза (Р < 0,001) (см. табл. 20).
Таблица 20
Показатели оксидативного гомеостаза у стельных коров
Срок стельности ПОА, отн. ед. АОА, отн. ед. К
8–30 дней (n = 8) 100,48 ± 21,91* 1,75 ± 0,38* 55,76 ± 5,8*
2–3,5 мес (n = 8) 78,08 ± 12,31* 1,14 ± 0,22* 76,74 ± 7,65*
5–7,5 мес (n = 5) 76,94 ± 14,43* 2,1 ± 0,85* 52,88 ± 10,3*
Контроль (n = 8) 278,3 ± 14,2 33,4 ± 2,15 8,3 ± 1,12
* Р < 0,001 по сравнению с контролем.
С
Совершенно иная картина была зафиксирована при
исследовании состояния ПОА и АОА сыворотки крови
коров с гнойно-катаральным эндометритом (табл. 21).
ПОА сыворотки крови у них была в 5,4 раза выше, чем
в контроле (P < 0,001). В то же время АОА сыворотки крови этой группы животных достоверно снижалась в 2,18
раза, а показатель КС был значительно выше (в 20,8 раза),
чем в контроле (Р < 0,001).
В результате лечения коров с гнойно-катаральным эндометритом с включением гинодиксина ПОА сыворотки
крови снизилась. Однако среднее значение данного по-
102
казателя было статистически недостоверным как по сравнению с исходными данными до лечения, так и с контролем, поскольку у двух коров ее параметры оставались
высокими. В то же время по сравнению с исходными
данными среднее значение АОА сыворотки крови коров
после их лечения гинодиксином достоверно снижалось
и существенно не отличалось от контроля. После лечения коров с гнойно-катаральным эндометритом гинодиксином среднее значение КС ПОА/АОА сыворотки крови
достоверно снижалось в 20,76 раза. Однако данный параметр в этом случае оставался достоверно высоким по
сравнению с контролем (см. табл. 21).
Таблица 21
Показатели оксидативного гомеостаза у больных коров
до и после лечения гинодиксином
Срок
исследования
До лечения
(n = 8)
После лечения
(n = 6)
Контроль
(n = 8)
* Р < 0,05; ** Р < 0,001 по сравнению с контролем; X Р < 0,05 по
сравнению со значениями до лечения.
ПОА, отн. ед.
1501,90 ± 346,51** 11,63 ± 1,92* 172,34 ± 30,46**
486,25 ± 184,02 25,41 ± 3,42Х21,66 ± 3,09*/
278,3 ± 14,2 33,4 ± 2,15 8,3 ± 1,12
АОА,
отн. ед.
К
С
Х
Результаты исследования дозозависимого антиоксидантного эффекта гинодиксина in vitro показали, что
в тест-системе Hb + Н2О2 + люминол максимальное количество хемилюминесцентных (ХЛ) импульсов составляет
9,5 · 105. При добавлении 10 % концентрации гинодиксина в эту систему число ХЛ импульсов снижалось вдвое,
а при 100 % – до 0,35 · 105, что свидетельствует о том,
что данный препарат обладает прямым антиоксидантным
действием (рис. 3).
103
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 7 14 21 мин
10
5
имп/м ин
Контроль 100%
75% 50%
25% 10%
Рис. 3. Дозозависимое антиоксидантное свойство гинодиксина
Таким образом, на разных сроках стельности и при
гнойно-воспалительном эндометрите коров выявлен разнонаправленный характер изменения ПОА сыворотки
крови. В то же время в обоих случаях отмечено выраженное снижение АОА сыворотки и повышение показателя
КС. Дисбаланс в системе «оксиданты–антиоксиданты»,
судя по параметру КС, в сторону усиления окислительных процессов в научной литературе обозначают как
феномен «окислительного стресса» (Меньщикова и др.,
2001). По цифрам КС на разных сроках стельности коров однозначно утверждать о развитии окислительного
стресса, вероятно, нельзя, поскольку абсолютные значения ПОА в сыворотке крови значительно ниже контроля.
При этом снижение антиоксидантного потенциала может
быть связано с активным потреблением антиоксидантов,
которые подавляют СРО, что в конечном итоге привело
к снижению ПОА. Данный факт может быть связан с изменениями гормонального статуса при беременности.
in vitro
104
При гнойно-воспалительном процессе в эндометрии
коров показатели соотношения ПОА/АОА свидетельствуют о преобладании прооксидантных факторов в крови. Отсюда можно сказать, что у коров с острым гнойновоспалительным процессом в эндометрии развивается
выраженный окислительный стресс, что может привести
к развитию структурных повреждений в результате непосредственного или опосредованного действия свободных
радикалов или вторичных продуктов индуцируемых ими
процессов, например, свободнорадикального ПОЛ (Slater
et al., 1988).
Лечение гинодиксином способствовало быстрому
устранению симптомов воспаления. Клиническая картина заболевания изменялась уже на следующий день
после введения препарата и характеризовалась первоначально резким увеличением количества выделяемых лохий, а затем их уменьшением и прекращением к 3–4-му
дню заболевания. Одновременно с этим изменялся характер маточно-влагалищных выделений. В цитограмме
выделений на второй день после лечения уменьшалось
количество деструктированных нейтрофилов и очаговых скоплений микрофлоры, увеличивалось количество
эпителиальных клеток. На 5-й день после лечения цитограмма характеризовалась единичными скоплениями
микробов, появлением симпластов ороговевающих и неороговевающих (суперфициальных) эпителиальных клеток и лейкоцитов.
Результаты исследования показали, что лечение больных коров гинодиксином приводит к снижению ПОА
и повышению АОА в сыворотке крови и соответственно
изменению их соотношения.
Таким образом, из полученных результатов можно
сделать следующие выводы:
105
– на разных сроках стельности коров наблюдается
снижение как ПОА, так и АОА сыворотки крови, что может свидетельствовать об усилении потребления антиоксидантов и защиты плода от действия деструктивных
прооксидантных факторов;
– достоверное повышение прооксидантного потенциала (ПОА), снижение АОА в сыворотке крови и рост
коэффициента соотношения ПОА/АОА (КС) свидетельствуют о развитии окислительного стресса при гнойнокатаральном эндометрите коров;
– лечение коров с гнойно-катаральным эндометритом гинодиксином снижает ПОА сыворотки за счет установленного прямого антиоксидантного действия данного
препарата.
3.2.5. Противовоспалительные свойства гинодиксина
Научные исследования в указанном направлении проводили совместно с М. Н. Скомаровой, Д. Д. Цырендоржиевым, В. В. Курилиным, М. А. Саперовой (ЗАО «Росветфарм», НИИ клинической иммунологии СО РАМН).
Оценку противовоспалительного действия препарата
на фоне экспериментального экссудативного воспаления
(ЭЭВ) правых задних конечностей крыс проводили комплексно с учетом следующих показателей: массы тела
в динамике, объема правых задних конечностей, общей
(ректальной) температуры, количества и состава лейкоцитов в периферической крови и экссудата из зоны поражения. Дополнительно оценивали суммарный хемилюминесцентный ответ (ХЛ-ответ) клеток (нейтрофилов)
крови и их реактивность, про- и антиоксидантную активность сыворотки крови.
Эксперименты проведены на 45 крысах-самцах линии Вистар массой 150–180 г. Животные получены из
106
вивария НИИ клинической иммунологии СО РАМН и содержались в стандартном режиме.
Экспериментальное экссудативное воспаление индуцировали введением в субплантарный (подошвенный)
апоневроз правой задней лапки крыс 0,05 мл полного
адъюванта Фрейнда («Sigma», США). Через 1 ч после
его введения начинали подкожное введение гинодиксина.
Животных разделили на три группы: контрольную
и две опытных. В контрольной группе 5 крысам вводили
по 0,05 мл физиологического раствора в субплантарный
(подошвенный) апоневроз правой задней лапки; в 1-й
опытной 20 крысам индуцировали ЭЭВ; во 2-й опытной
20 крысам с индуцированным ЭЭВ вводили гинодиксин.
Животных опытных групп подвергали эвтаназии через 1, 3, 7 и 14 суток после введения адъюванта Фрейнда
и гинодиксина, а контрольной – на 14-е сутки, соблюдая
«Правила работы с лабораторными животными».
Оценку окислительно-метаболической функции клеток крови (нейтрофилов) животных проводили с помощью хемилюминесцентного (ХЛ) метода исследования.
Для оценки способности нейтрофилов нарабатывать активные метаболиты кислорода (АМК), обеспечивающие
потенциальную биоцидность фагоцитирующих клеток,
использовали метод люминол-зависимой хемилюминесценции (Маянский и др., 1996). ХЛ-исследование проводили в спонтанном и зимозан-индуцированном режиме.
Для оценки реактивности клеток крови рассчитывали индекс стимуляции (ИС) по следующей формуле:
ИС = ЗГ-индуцированная I
/ спонтанная I
sum
. (1)
sum
Определение общей прооксидантной активности
(ПОА) сыворотки крови крыс проводили по методу
Д. Н. Маянского и др. (1996). В качестве тест-системы
использовали лейковзвесь интактных крыс.
107
Оценку ПОА сыворотки крови животных осущест-
IO
II
ON
()
/.
вляли по индексу стимуляции (ИС), который рассчитывали по формуле
где I
O – светосумма ХЛ-ответа клеток лейковзвеси на
sum
ÏÎÀ =
тестируемую сыворотку крови; I
sum
ISp
sum
(2)
,
Sp – светосумма ХЛ-
sum
ответа клеток лейковзвеси без добавления сыворотки крови. Результаты выражали в условных единицах (у. ед.).
Антиоксидантную активность (АОА) сыворотки крови крыс определяли по модифицированному методу (Журавлев, Журавлева, 1975).
АОА сыворотки крови выражали в условных единицах (у. ед.), которые соответствовали кратности подавления ХЛ, индуцируемой Н2О2 в присутствии сыворотки за
все время исследования, и рассчитывали по формуле
AOA =
−
,
(3)
I
N
где IO – начальное значение ХЛ-светимости; IN – конечное.
Все хемилюминесцентные исследования проводили с помощью биохемилюминометра «СКИФ-0306М»
(СКТБ «Наука», Красноярск, Россия).
Для более тщательного изучения взаимодействия
про- и антиоксидантной систем рассчитывали коэффициент их соотношения, который определяли по формуле
KÏÎÀ ÀÎÀ
=
c
(4)
⋅
100
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью лицензионных пакетов прикладных программ «Statistica 5.0» и «Microsoft Ecxel 7.0».
Различия сравниваемых показателей считались достоверными при P < 0,05.
Результаты исследования показали, что уже через
сутки после введения адъюванта Фрейнда развивается
108
экссудативное воспаление правой задней лапки крыс.
Так, объем правой задней лапки (Vпр) крыс вырос в 3,6
раза по сравнению с животными контрольной группы
(1,30 ± 0,04 мл) и в среднем составил 4,70 ± 0,15 мл. На
последующих сроках исследования (3, 7 и 14-е сутки) Vпр
с экссудативным воспалением постепенно снижался до
3,90 ± 0,24; 3,40 ± 0,12 и 2,50 ± 0,16 мл соответственно.
При введении гинодиксина Vпр в 1-й опытной группе
снижался быстрее, чем у крыс 2-й, хотя после однократной инъекции препарата данный показатель практически не менялся (1-е сутки). На 3, 7 и 14-е сутки различия
в изменениях V
между крысами опытных групп были
пр
более заметными. Так, на 3-и сутки после введения препарата Vпр лапки крыс достиг 3,40 ± 0,11 мл, а к 14-м суткам – 1,60 ± 0,13 мл.
Таким образом, к 14-м суткам отечность пораженной
конечности крыс сохранялась, но у крыс, которым вводили гинодиксин, она была менее выражена.
Развитие экссудативного воспаления сопровождалось повышением ректальной температуры. У крыс контрольной группы она составила 37,8 ± 0,08 ºC.
Введение гинодиксина крысам с ЭЭВ (2-я опытная
группа) приводило к более заметному снижению ректальной температуры. Однако повышенный уровень ее,
хотя и менее выраженный, чем у крыс 1-й группы, сохранялся до 14-х суток исследования. Так, среднее значение
ректальной температуры в динамике исследования (1, 3,
7 и 14-е сутки) после введения гинодиксина составило
39,20 ± 0,15; 39,80 ± 0,23; 38,40 ± 0,15 и 38,20 ± 0,16 ºC
соответственно.
При развитии ЭЭВ отмечали значительное снижение массы тела крыс, что связано с постоянными
болевыми и температурными реакциями. У крыс кон-
109
троль
ной группы до начала эксперимента она составляла в среднем 169,40 ± 1,76 г, а в день забоя (14-е сутки) –
188,20 ± 1,89 г, что на 11,1 % выше исходного состояния.
В то же время в динамике развития ЭЭВ (1-я опытная
группа) наблюдалось неуклонное снижение массы тела
крыс. Так, ее максимальное снижение у данной группы регистрировали на 7-е сутки исследования (на 17,40 ± 0,61 %
относительно исходной массы до начала опытов), а на
14-е сутки характер снижения массы животных оставался практически на том же уровне (10,80 ± 0,75 %).
Введение гинодиксина препятствовало резкому снижению массы тела у крыс с ЭЭВ. Так, на 7-е сутки исследования снижение во 2-й группе животных относительно исходного показателя до начала опытов составило
9,1 ± 0,8 %, а на 14-е сутки – 4,2 ± 0,9 %.
Один из важных показателей активности воспалительного процесса – изменение клеточного состава периферической крови, а также крови в зоне поражения.
Особенно это касается смены его клеточного состава:
полинуклеаров (нейтрофилов) на мононуклеарные клетки (моноциты и лимфоциты). Известно, что увеличение
количества нейтрофилов свидетельствует об активности
острого воспаления, ускоренная их смена на моноциты
и лимфоциты – об усилении репаративных процессов
(Маянский, Урсов, 1997).
Результаты исследования показали, что общее количество лейкоцитов в периферической крови крыс на всем
протяжении наблюдения после индукции ЭЭВ оставалось на достоверно высоком уровне. В то же время введение гинодиксина приводило к заметному снижению их
числа в крови уже к 3-м суткам наблюдения, затем неуклонно происходило уменьшение.
Снижение общего количества лейкоцитов под действием тестируемого препарата в основном происходи-
110
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]