Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 81

и срезах мозга как нормо-, так и гипотермических крыс в течение 5, 10 и 15 мин поглощение γ-аминомасляной кислоты нарастало в одинаковой степени, затем

к 30-й мин инкубации оно у гипотермических животных значительно снижалось по сравнению с нормотермическими.

Инкубация срезов мозга при 37 °С у контрольных и охлажденных (20 °С) крыс приводила почти к одинаковому поглощению основной аминокислотыгистидина в течение 5, 10 и 15 мин, при дальнейшей инкубации­ до 30 мин оно происходило в срезах мозга гипотермических крыс более интенсивно, нежели у контрольных.

На сохранение относительно высокой способности поглощения аминокислот срезов мозга охлажденного организма в условиях низкой­ температуры инкубации (20 °С), по всей вероятности, оказывают влияние сложные метаболические превращения дикарбоновых аминокислот,­ γ-аминомасляной кислоты, валина и гистидина в мозге при гипотермии.

3.14. АМИНОТРАНСФЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС РАЗНОГО ВОЗРАСТА ПРИ ГИПОТЕРМИИ

Исследована аспартат- и аланинаминотрансферазная активность и тканях головного­ мозга крыс разного возраста (1, 4, 12–14, 16, 22 сут.; 1, 1,5 и 3 мес.

и2 года) при гипотермии 20–19 °С. Найдено, что гипотермия приводит к снижению как общей, так и удельной активности наследуемых ферментов в развивающемся мозге. Активность аланинаминотрансферазы, намеренная в гомогенатах тканей мозга при температуре 37 и 20–19 °С, изменяется значительнее, чем активность аспартатаминотрансферазы.

Широкое применение метода охлаждения организма в практической медицине [11] и в экспериментальной биологии [1–3] требует его теоретического­ обоснования. Мозг млекопитающих особо чувствителен к снижению­ температуры тела и функционирует при более узком диапазоне температур, чем другие ткани [4]. Важной биохимической особенностью мозга является сопряжение азотистого и энергетического метаболизма благодаря высокой активности аминотрансфераз [5]. Нашими предыдущими работами [7] показано, что аспартат-

иаланинаминотрансферазная активность мозга при охлаждении организма

подвергаются значительным изменениям. Установлено, что при гипотермии­ изменяются температурная зависимость активности и изоферментный спектр аминотрансфераз мозга. Становление метаболизма мозга [8] и терморегуляционных процессов [9] происходит в онтогенезе.

Из вышеизложенного вытекает задача нашего исследования – изучение­ активности аминотрансфераз мозга при гипотермии в ходе постнатального­ развития.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 83

вели равномерно и достигали за 55–60 мин. Животных декапитировали, быстро извлекали большие полушария головного мозга и гомогенизировали по

холоду. Активность аспартатаминотрансфе­разы и аланинаминотрансферазы определяли­ в гомогенатах по методу Райтмана н Френкеля [10] с некоторыми нашими модификациями­ [6]. Исследуемые ферментативные активности выражали в мкмоль пирувата на 1 г сырой ткани за 30 мин (общая активность). Удельную активность выражали в нмолях пирувата на 1 мг белка за 1 мин. Белок определяли по методу Лоури [11]. Все пробы инкубировали при 37 °С и при температуре, соответствующей температуре тела охлажденного животного.

Таблица 21 Активность аспартат- и аланинаминотрансфераз в тканях мозга крыс (в

нМоль пирувата на 1 мг белка за 1 мин инкубации, x±Sx, n=10)

Выявлено, что аспартатаминотрансферазная (ААТ) активность, измеренная при температуре инкубации 37 °С, особым изменениям в постнатальном развитии не подвергается,­ а аланинаминотрансферазная (АлАТ) активность увеличивается (у старых животных она в 3,6 раза выше, чем у новорожденных;

(табл. 20)).

Активность ААТ при инкубации гомогенатов мозга в условиях 20–19 °С у крысят 4–9-й групп почти в 2 раза выше, чем у новорожденных, активность АлАТ при

этом в 1,6–6 раза выше у крысят 2–8-й групп, а у старых она в 1,4 раза ниже по сравнению с 3-месячными, оставаясь в 4,4 раза выше, чем у новорожденных.

Возрастная динамика удельной активности этих ферментов несколько отличается. Удельная активность ААТ при инкубация в 37 °С к 4 сут. жизни остается без изменений, затем с началом прогревания со становлением­ терморегуляционной функции (к 12–14 сут.) она снижается на 30 %, приближаясь в последующие сроки к уровню взрослых. При инкубации тканей мозга в условиях 20–19 °С активность ААТ до месячного возраста­ не меняется, в дальнейшем она снижается до уровня, характерного для взрослых животных. Динамика удельной активности АлАТазы приобретает­ фазовость как при инкубации в 37 °С, так и при 20– 10 °С (табл. 21). Отличия в динамике общей и удельной активности аминотранс­ фераз, по-видимому, связаны, с одной стороны, с возрастными изменениями содержания общего белка и влиянием температуры инкубации – с другой­.

Таблица 22 Активность аспартат- и аланинаминотрансфераз в тканях мозга крыс

при гипотермии (20–19 °С в мкМоль пирувата на 1 г сырой ткани за 30 мин инкубации, x±Sx, n=10)

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 85

Глубокая гипотермия (20–19 °С) в постнатальном развитии приводит

кснижению общей и удельной активности как ЛАТ, так и АлАТ (табл. 23 и 24).

Снижение активности ААТ при гипотермии в большей степени выражено­ у новорожденных, 4-дневных, 2- и 3-недельных крысят. После 1 мес. жизни активность фермента стабилизируется примерно на одном уровне, несколько снижаясь у старых в возрасте 2 лет.

Удельная активность­ ААТ по динамике не отличается от динамики общей активности. Динамика активности АлАТ при этом несколько отличается. У новорожденных активность АлАТ при гипотермии снижается в 2–3 раза, у 4-дневных почти в 6 раз, у 2-недельных в 4 раза, снижение у 3-недельных такое же, как и у новорожденных. После 1 мес. жизни, так же, как и у ААТ происходит стабилизация активности.

Глубокая гипотермия (19–20 °С) вызывает более значительные изменения активности АлАТ, чем ААТ.

Полученные результаты показывают, что с возрастом происходит увеличение содержания общего белка в тканях мозга. Изменения общей активности ААТ у нормотермических крыс с возрастом не происходят, а ее удельная активность снижается. Для удельной активности АлАТ в развивающемся мозге характерна фазовость, а для ее общей активности – повышение. Сходная динамика активности фосфопротеинфосфатазы в лимфатической ткани крыс разного возраста обнаружена и другими авторами [12]. В исследованиях на крысах разного возраста было показано, что становление функций мозга от начала прогревания (12–14 сут.) до

проявления свойственной взрослым биоэлектрической активности коры мозга к месячному возрасту сопровождается увеличением содержания цитохрома [9]. После месячного возраста содержание цитохрома изменяется мало. В процессе индивидуального развития клетки мозга претерпевают весьма существенные изменения. Можно думать, что эта лабильность является одним из условий, обеспечивающих возможность перехода организма

квзрослому состоянию [13].

Глубокое охлаждение (20–19 °С) не может вызывать одинаковую реакцию у развивающегося мозга. Сдвиги в активности аминотрансфераз связаны с внутриклеточным перераспределением ферментных молекул из одного компартмента в другой. В пользу такого предположения могут быть изменения содержания белка в митохондриальной, цитоплазматической фракциях мозга и в суммарной водорастворимой фракции.

При охлаждении организма происходит значительное изменение соот­ ношения скоростей различных реакций в клетках [15]. В этих новых условиях температурные зависимости ферментов должны изменяться так, чтобы соот-

ветствовать этим новым изменившимся условиям.

Литература

1.Волколаков Я. В., Лацис А. Т. Глубокая гипотермия в кардиохирургии дет­ ского возраста. М.: Медицина, 1977. 206 c.

2.Эмирбеков Э. З. Функциональная нейрохимия. Махачкала, 1980. 128 c.

3.Эмирбеков Э. З., Абдуллаев Р. А., Исма­илов И. А. Белки мозга теплокровного организма при пониженных температурах тела // Биохимия животных и человека. Киев: Наук. думка, 1980. вып. 4. С. 84–90.

4.Meyers R. O. Neurochemical mechanisms of temperature regulation and food ingestion // In: Neurohumor Goding Brain Functions. New York; London, 1974. p. 99–144.

5.Strecker H. J. Biochemistry of selected amino acids // In: Handbook of Neurochemistry. Metabolic reactions in the nervous system. New York; London, 1970. vol. 4. p. 173–207.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 87

6.Эмирбеков Э. З., Мукаилов М. И. Активность некоторых ферментов азотистого обмена мозга при гипотермии // Вопр. мед. хим. 1972. т. 17. вып. 4. С. 406–409.

7.Даудова Т. Н., Мейланов И. С., Эмирбеков Э. З., Мукаилов­ М. И. Иссле­ дование активности и температурной зависимости аспартат- и аланинаминотрансфераз в мозге крыс в постгипотермический период. // Деп. ВИНИТИ, 1980. 42 с.

8.Лазарева З. Д. Биохимия развивающегося мозга. М.: Меди­цина, 1972. 312 С.

9.Корниенко И. А. Возрастные изменения энергетического обмена и терморегуляции. М.: Наука, 1979. 151 c.

10.Reitman S., Frankel S. A colorimetric method for Hie determination of serum glutamic pyruvic trausaimnflses // Am. J. Clin. Path. 1957. vol. 28. No 1. p. 56–63.

11.Lowry О. H., Rosenbrough Х. J., Fair A. L., Randell R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. 1951. vol. 193. No 1. p. 265–275.

12.Мукаилов М. И. Влияние низкой температуры на активность амино­ трансфераз головного мозга у крыс разных возрастов // Механизмы пластичности­ мозга: Материалы Всес. симпозиума. (Махачкала, 29–30 сентября 1982 г.). Махачкала, 1982. т. 2. С. 42.

13.Гордиенко Э. А., Жубрикова Л. А. Онтогенетические различия глутамат декарбоксилазной, ГАМК-аминотрансферазной, моноаминоксидазной­ активностей митохондрий коры больших полушарий и гипоталамической области мозга // Укр. биохим. ж. 1980. т. 52. № 4. С. 423–428.

14.Мукаилов М. И. Температурная зависимость аспартат- и аланинаминотрансфераз в мозге крыс в постгипотермический период // Актуальные

проблемы современной науки. Махачкала,­ 1982. С. 243–244.

3.15. ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ НА ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ МОЗГА

Основным механизмом защитного действия общего охлаждения организма является­ снижение скорости реакции метаболизма в органах и тканях соответственно степени гипотермии­. Однако при этом наблюдается дискоординация в скорости ферментативных реакций, нарушается взаимоотношение азотистого и углеводного обмена в мозге. Центральное место в регуляции азотистого и углеводного­ обмена мозга занимает глутаминовая кислота. Одним из важнейших путей этой регуляции является активность глутаматдегидрогеназы (ГДГ), которая осуществляет синтез­ глутаминовой кислоты и участвует в образо­ вании аммиака. Как показано предыдущи­ми работами нашей лаборатории, при гипотермии­ крыс происходит резкое изменение метаболизма­ глутаминовой кислоты и накопление аммиака­ в тканях мозга.

В связи с изложенным в настоящем исследовании­ изучали влияние гипотермии различной глубины­ и продолжительности на активность ГДГ в мозге.

Таблица 24 Глутаматдегидрогеназная активность больших полушарий мозга крыс

(в нмоль НАДН2 на 1 мг белка за 1 мин) при гипотермии (М±m, данные 6–7 опытов)

Примечание. Р – достоверность различия по отношению к контролю, P1, Р2, Р3 – к предыдущему этапу гипотермии.

Опыты проводили­ на беспородных белых крысах-самцах массой 200–250 г. Гипотермию вызывали в специальных камерах, через рубашку которых циркулировала­ холодная вода (4 °С). Ректальную температуру снижали равномерно, так что в течение­ 15–20 мин она достигала 30 °С, а за 50–60 мин – 19–20 °С. С целью изучения пролонгированной­ гипотермии температуру тела у крыс, равную 30 и 20 °С, поддерживали в течение 1 ч. В качестве контроля использовали интактных животных. Контрольных и подопытных крыс де­ капитировали, быстро извлекали на холоде мозг (большие полушария) и переносили в необходимый­ объем фосфатного буфера рН 7,8. Для приготовления­ гомогената использовали гомогенизатор­ Портера – Эльвегейма с тефлоновым пести­ком. Активность ГДГ в экстракте 20 % гомоге­ната определяли спектро-

фотометрическим методом­ в реакции восстановительного аминирования. Использовали реакционную смесь следующего­ состава: 0,2 мл 0,2 нмоль раствора НАД Н2, 0,2 мл 0,2 нмоль раствора α-кетоглутарата, 0,2 мл экстракта гомогената и 0,2 мл 0,33 М раствора NH4Cl. Конечный объем смеси доводили до 3 мл раствором 1/15 М фосфатного буфера рН 7,8, содержащим­ 5 ммоль ЭДТА. Реакцию начинали добавлением­ НАДН2 и измеряли в течение

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 89

1–2 мин. Активность выражали в наномолях НАДН2 на 1 мг белка за 1 мин. Концентрацию белка в пробах определяли методом Лоури [10]. Измерения

ферментативной активности проводили­ при температуре инкубации 37 °С, а также при температуре, соответствующей температуре тела охлажденного животного (30 и 20 °С).

Как видно из таблицы 24, в тканях больших полушарий мозга интактных крыс обнаружена довольно высокая активность ГДГ при всех исследованных температурах­ инкубации. Снижение температуры инкубации­ гомогенатов тканей мозга нормотермических­ животных с 37 до 20 °С сопровождалось значительным торможением ферментативной активности:­ при 30 °С это снижение составляет 27,6 %, а при 20 °С – 45,1 % по сравнению с исходной величиной активности, измеренной при 37 °С.

При умеренной гипотермии (30 °С), когда крысы­ находятся в возбужденном состоянии, глутаматдегидрогеназная активность в больших полушариях­ мозга при всех исследованных температурах­ инкубации (37, 30 и 20 °С) увеличивается незначительно. Активность ГДГ при этом в условиях­ температуры инкубации гомогенатов 30 и 20 °С снижается соответственно на 22,5 и 50,0 % по сравнению с таковой при температуре инкубации­ 37 °С.

Пролонгирование умеренной гипотермии в течение­ 1 ч приводит уже к более заметному повы­шению активности ГДГ мозга. Так, активность фермента в условиях температуры инкубации проб 37, 30 и 20 °С соответственно на 13,2, 20,8 и 17,0 % выше таковой у контрольных нормотермических­ крыс. Однако степень снижения активности­ ГДГ при уменьшении температуры инкубации­

на данном этапе гипотермии остается почти в пределах таковой у контрольных и кратковременно­ охлажденных животных (22,7 и 42,2 %).

При глубокой гипотермии (20 °С), когда крысы­ находятся в состоянии «холодового наркоза», активность ГДГ в мозге отличается только лишь при температуре инкубации проб, соответствующей­ температуре тела охлажденного животного (20 °С); она на 18,6 % выше таковой у крыс, перенесших­ умеренную пролонгированную гипотермию­ (30 °С).

Пролонгирование глубокой гипотермии в течение­ 1 ч приводит к значительному увеличению активности ГДГ в мозге. Так, при инкубации проб тканей больших полушарий мозга при 37, 30 и 20 °С это увеличение составляет соответственно­ 25,9; 26,7 и 21,0 % по сравнению с активностью у крыс при пролонгированной гипотермии­ (30 °С).

Степень снижения активности ГДГ в мозге в зависимости от снижения температуры инкубации­ проб тканей почти не изменяется и при пролонгировании­ состояния глубокой гипотермии (это снижение при температуре инкубации 30 °С составляет 22,0 %, а при 20 °С – 47,1 % по сравнению­ с активностью фер-

мента при температуре инкубации 37 °С).

Таким образом, можно заключить, что снижение­ температуры тела животного приводит к повышению­ в тканях мозга активности ГДГ, определяемой­ при

температурах инкубации 37, 30 и 20 °С. Представляет интерес тот факт, что, по нашим данным, при определенных режимах ги­потермии глутаматдегидрогеназная активность, измеренная при более низкой температуре инкубации,­ либо выше, либо не отличается от таковой­ при более высокой температуре.

В предыдущих работах нашей лаборатории также обнаружена высокая активность митохондриальных ферментов азотистого обмена мозга охлажденных животных при более низких температурах инкубации. Известно, что сукцинатдегидрогеназная активность митохонд­рий мозга охлажденных животных, определяемая­ при более низких температурах инкубации, выше, чем при высоких температурах. Однако механизм этого процесса не выяснен. Возможно, что повышение активности ГДГ мозга в наших опытах отчасти является результатом изменения­ при гипотермии проницаемости митохондрий для глутаминовой кислоты. Известно, что гипотермия­ хотя и не влияет на капиллярную проницаемость­ аминокислот, но оказывает значительное­ действие на их клеточную проницаемость в мозге. Между активностью ферментов метаболизма­ глутаминовой кислоты и содержанием ее в мозге при различных гипотермических состояниях­ выявлена корреляция. По-видимому,­ повышение активности ГДГ в тканях мозга при низких температурах тела позволяет обеспечить­ синаптический контакт достаточным количеством медиатора – глутаминовой кислоты, что можно рассматривать как приспособительную реакцию.

3.16. АКТИВНОСТЬ ГЛУТАМИНАЗЫ МОЗГА ЗИМОСПЯЩЕГО ЖИВОТНОГО ПРИ ГИПОТЕРМИИ

Определяли активность глутаминазы-1 в больших полушариях­ мозга,

вмозжечке и в среднем и промежуточном мозге малых сусликов, подвергнутых охлаждению до ректальной­ температуры 30, 20–19 и 10 °С. В изученных отделах­ мозга активность глутаминазы-1 снижается в зависимости­ от глубины гипотермии. В средней и промежуточ­ном мозге при температуре тела 10 °С дальнейшее снижение активности этого фермента прекращается.

Искусственное снижение температуры тела теплокровных животных приводит к резкому нарушению азотистого метаболизма мозга. У животных, впадающих в зимнюю спячку, при гипотермии в тканях мозга увеличивается содержание аммиака и глутамина.

Нас интересовало, как изменяется активность глутаминазы-1 (КФ 3. 5. 1. 2)

втканях мозга сусликов при различной температуре тела.