Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 51

взаимоотношений­ компонентов системы аммиак – глутаминовая кислота. Эти процессы через цикл трикарбоновых кислот влияют на энергетический

ипластический обмен мозга. Это и послужило основанием для исследования­ динамики ГАМК и сопряженных с ее обменом компонентов при многократном­ охлаждении организма и последующем согревании.

Опыты были поставлены на белых крысах весом 200–250 г. Гипотермию­ вызывали помещением животных в ванну с холодной водой (+4 … +6 °С). Ректальную температуру снижали равномерно до 20–19 °С в течение 60–65 мин. После охлаждения крысы согревались самостоятельно­ при комнатной температуре. Всего проведено 13 повторных­ охлаждений с интервалами в 3–5 дней. После однократной, семикратной­ и тринадцатикратной гипотермии крыс, как

иконтрольных, быстро­ декапитировали. Голову моментально опускали в сосуд с жидким­ азотом. После замораживания извлекали мозг и в надосадочной жидкости трихлоруксусного экстракта определяли γ-аминомасляную кислоту, глутаминовую и аспарагиновую кислоты электрофорезом на бумаге по Дозе.

Исследования проводили на двух группах животных: а) после охлаждения­ до 20–19 °С, б) сейчас же после согревания до 37–37,5 °С.

Семикратная гипотермия вызывает у крыс увеличение содержания γ-аминомасляной кислотаы в мозге почти в 2,8 раза по сравнению с однократноохлажден­ными (табл. 7). Содержание γ-аминомасляной кислоты в мозге подопытных животных в 1,4 раза выше, чем у контрольных крыс. Аналогичная динамика наблюдается­ и в отношении содержания аспарагиновой кислоты. Содержание же глутаминовой кислоты в мозге при однократной и семикратной

гипотермии­ животного не изменяется по сравнению с контрольными опытами. 13-й сеанс охлаждения приводит к снижению содержания γ-аминомасляной кислоты в мозге животного по сравнению с 7-м сеансом почти в 2 раза. Но уро­ вень ее все еще выше, чем у однократно охлажденных крыс. Содержание­ аспарагиновой кислоты при этом уменьшается на 37,4 % по сравнению с 7-кратным охлаждением.

Интересно отметить, что у исследованных групп животных направлен­­ ность изменений γ-аминомасляной кислоты и аспарагиновой кислоты однотипна. Содержание­ же глутаминовой кислоты почти стабильно.

Данные определения γ-аминомасляной кислоты, глутаминовой и аспарагиновой кислот в мозге подопытных крыс после самосогревания приведены в таблице 8. Содержание γ-аминомасляной кислоты в мозге согретых животных после однократного и 12-кратного сеанса охлаждения по сравнению с гипотермическими крысами­ статически достоверно не изменяется. На 33,2 % (Р<0,01) уменьшается­ концентрация γ-аминомасляной кислоты при согревании после 7-кратной гипотермии. Согревание животных после однократной гипотермии уменьшает содержание­ глутаминовой кислоты в мозге на 13,6 % (Р<0,01).

В дальнейшем­ количество ее почти не изменяется по сравнению с гипотермиче­ скими крысами. При последующем согревании 1–7-кратно охлажденных крыс содержание аспарагиновой кислоты в мозге снижается, соответственно, на 45,8 % и 19 % по сравнению с охлажденными животными­. Согревание после 13го сеанса гипотермии не изменяет ее концентрацию­.

Таблица 7 Содержание γ-аминомасляной кислоты, глутаминовой и аспарагиновой

кислот в мозге крыс при многократной гипотермии (20–19 °С), мг %

Таблица 8 Содержание γ-аминомасляной кислоты, глутаминовой и аспарагиновой кислот

в мозге крыс при самосогревании после многократной гипотермии, мг %

Сравнительно низкие концентрации γ-аминомасляной кислоты, глутаминовой и аспарагиновой­ кислот в мозге после согревания по сравнению с охлаж­ денными крысами, видимо, свидетельствуют о том, что они используются­ для

энергетических целей. Данные показывают, что чем больше сеансов­ охлаждений, тем менее изменяются концентрации определяемых аминокислот. При нормальной температуре тела, через 3 дня после 12-кратной гипотермии, содержание γ-аминомасляной кислоты и аспарагиновой кислоты возвращается­ до уровня их в мозге интактных животных. Но содержание глутаминовой кислоты остается намного ниже (17,3 %).

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 53

Таким образом, γ-аминомасляная, глутаминовая и аспарагиновая кислоты активно­ вмешиваются в метаболические процессы мозга при гипотермии и играют важную роль в механизмах адаптации к холоду.

3.6. АМИДНЫЕ ГРУППЫ БЕЛКОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА СУСЛИКОВ ПРИ ГИПОТЕРМИИ

Исследовали содержание лабильных и прочносвязанных амидных групп,

аводонерастворимой, суммарной водорастворимой и четырех отдельных водорастворимых фракциях белков головного мозга сусликов малых при охлаждении до 35, 30, 25, 20 и 10 °С.

Втретьей и четвертой водорастворимых фракциях белков на начальных этапах гипотермии (35–25 °С) содержание амидных групп увеличивается,

апри дальнейшем­ снижении температуры тела возвращается к норме. Во всех остальных фракциях­ белков в зависимости от снижения температуры тела происходит значительное уменьшение количества амидных групп.

Гипотермия сусликов сопровождается различными изменениями в соотношении лабильных и прочносвязанных амидных групп.

При гипотермии теплокровного животного азотистый метаболизм мозга резко нарушается, в частности, в нем увеличивается содержание­ аммиака. Донатором и акцептором аммиака в мозге могут быть белки.

Всвязи с этим мы исследовали содержание лабильных и прочносвязанных­

амидных групп четырех водорастворимых и суммарной водорастворимой фракций белков головного мозга сусликов при искусственно­ пониженной температуре тела.

Эксперименты проведены на 72 сусликах малых (Citellus pуgmaeus Pall.), от­ ловленных в Дагестане в мае 1970 г. В июне животных подвергали охлаждению при помощи холодовых одеял до ректальной температуры 35, 30, 25, 20 и 10 °С. Контролем служили нормотермические бодрствующие животные.

Контрольных и подопытных животных быстро декапитировали. Извлеченный мозг (без мозжечка) замораживали при –14–16 °С. В каждый опыт брали мозг двух сусликов. Из гомогената мозга водорастворимые белки экстрагировали в течение 16–18 ч при 0 °С. Осадок отделяли путем центрифугирования и анализировали как водорастворимую фракцию. Белки суммарной водорастворимой фракции осаждали охлажденной­ 12 %-ной трихлоруксусной кислотой. Из фракции водорастворимых белков выделяли четыре фракции и называли их условно первой, второй, третьей и четвертой. Чтобы удалить воду и липиды все белковые фракции отмывали органическими раствори­ телями.

Белки высушивали в термостате при 37 °С и определяли в них сумму амид­ ных групп и содержание их лабильной и прочносвязанной фракций. Для этого белки гидролизовали в 1-Н растворе серной кислоты на водяной бане при 100 °С в течение 10 мин и 2 ч. О содержании амидных групп судили по количеству азота аммиака­ гидролизата.

На начальных этапах гипотермии (35 и 30 °С) количество суммарных­ амидных групп достоверно увеличивается лишь в четвертой фракции водорастворимых белков; в первой фракции оно достоверно снижается (табл. 9). В остальных фракциях в этих условиях изме­нения недостоверны. При охлаждении сусликов до 25 °С амидированность­ белков водонерастворимой и водорастворимой фракций уменьшается, соответственно, на 39,3 и 42,9 %, причем это понижение происходит за счет снижения содержания как лабильных, так и прочносвязанных­ амидных групп (табл. 10).

Охлаждение животных до 20 и 10 °С не приводит к дальнейшему изменению амидированности белков водорастворимой и водонерастворимой­ белковых фракций. Соотношение лабильных и прочносвязанных­ амидных групп белков при температуре тела сусликов 10 °С в водонерастворимой фракции составляет 0,71 (у нормальных – 0,48), в водорастворимой же фракции – 0,41 (в норме – 0,63).

У охлажденных до 25 °С животных содержание амидных групп в первой фракции водорастворимых белков снижается на 53,7 %, при этом соотношение лабильных и прочносвязанных групп уменьшается по сравнению с нормой и составляет 66,8 %, а соотношение лабильных и прочносвязанных­ амидных

групп – 0,63.

Содержание амидных групп в белках второй водорастворимой фракции при 25 °С также снижается на 46,9 %. При дальнейшем охлаждении­ животных до 10 °С содержание амидного азота белков не изменяется, а соотношение лабильных и прочносвязанных амидных групп увеличивается до 0,74 (в контроле – 0,54).

Втретьей фракции водорастворимых белков при 25 °С наблюдается­ снижение содержания лишь прочносвязанных амидных групп, вследствие чего соотношение лабильных и прочносвязанных амидных групп увеличивается с 0,64 до 0,81. Снижение температуры тела сусликов­ до 20 °С вызывает дальнейшее снижение амидированности белков­. У животных с температурой тела 10 °С не наблюдается достоверных­ изменений в амидированности белков этой фракции по сравнению с животными, охлажденными до 20 °С.

Вчетвертой фракции водорастворимых белков в отличие от первых трех количество лабильных амидных групп больше, чем прочносвязанных­. При гипотермии 25 °С содержание последних в ней резко увеличивается (на 63,3 %),

алабильных снижается на 17 %. Более глубокое охлаждение (20–10 °С) вызывает

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 55

снижение суммарного содержания­ амидных групп белков в этой фракции почти до уровня контроля.

Таблица 9

Содержание амидных групп в различных фракциях водорастворимых белков мозга сусликов при гипотермии (в мкмолях аммиака на 1 г сухого белка; n = 6; М±m)

Полученные данные свидетельствуют об активном участии амидных­ групп в обмене белков мозга при понижении температуры тела. Можно думать, что амидные группы, участвуя­ посредством образования водородных связей в ассоциации белковых­ молекул между собой, значительно понижают растворимость белков.

Обнаруженные нами изменения в содержании и лабильности амидных­ групп в отдельных фракциях белков, видимо, существенно сказываются­ на физикохимических свойствах, а следовательно, и биологической­ активности белков.

Известно, что активность некоторых ферментов, например креатинфосфокиназы, зависит от количества амидных групп. Кроме того, видимо, белки мозга, участвуя в освобождении и связывании аммиака, косвенно влияют на функциональную деятельность гипотер­мических животных, что согласуется с данными предыдущих наших исследований.

3.7. АЗОТИСТЫЙ И УГЛЕВОДНО-ФОСФОрНЫЙ ОБМЕН МОЗГА ТЕПЛОКРОВНОГО ЖИВОТНОГО ПРИ ГИПОТЕРМИИ И ЗИМНЕЙ СПЯЧКЕ

При гипотермии и зимней спячке в мозге сусликов (Citellus pygmaeus Pall.) содержание­ аммиака, глютамина, глюкозы, АТФ и креатинфосфата увеличивается, количество­ мочевины, молочной кислоты и лабильных амидных

групп белков снижается. Изменение содержания азотистых и углеводнофосфорных метаболитов мозга при принудительном­ охлаждении сусликов аналогичны изменениям при зимней спячке и имеют много общего с нарушениями азотистого и углеводно-фосфорного метаболизма мозга незимоспящих грызунов, адаптированных к холоду или перенесших пролонгированную гипотермию.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 57

Использование гипотермии в экспериментальной и клинической практике сдерживается отсутствием достаточного фактического мате­риала о характере­ биохимических процессов, протекающих в мозге при снижении температуры тела. Целью настоящей работы было изучение­ азотистого и углеводно­- фосфорного метаболизма головного моз­га зимоспящих животных, которые, как известно, легко переносят значительное­ снижение температуры тела.

Опыты поставлены на малых сусликах (Citellus pygmaeus Pall.) 3 возрастов: прозревающих­ (12–15 дней), месячных и взрослых. Животных подвергали принудительному­ охлаждению до температуры тела 10 °С либо в холодильнике (прозревающие и месячные),­ либо с помощью холодовых одеял (взрослые суслики). Исследования по зимней­ спячке начинали в октябре, в период впадения сусликов в спячку. Подопытных животных,­ находившихся в индивидуальных клетках, помещали в комнату с температурой­ 8–9 °С. По достижении нужного состояния зверьков быстро декапитировали, голову замораживали в жидком азоте, извлекали мозг (без мозжечка) и растирали его при непрерывном охлаждении в порошок. Белки осаждали 5 %-ной ТХУ. В суммарных белках определяли содержание аммиака, глютамина, глютаминовой, аспарагиновой и γ-аминомасляной кислоты, мочевины, глюкозы, молочной кислоты, неорга­ нического фосфора. О количестве креатинфосфата­ (КФ) судили по разнице между суммой Рнеорг+Ркф и неорганическим фосфором. Сумму АТФ+АДФ измеряли после 10-минутного гидролиза­ их ртутных осадков в 1 Н HCl.

Из табл. 11 видно, что как принудительное, так и физиологическое снижение температуры тела резко увеличивает содержание аммиака и глютами-

на в ткани мозга месячных и взрослых сусликов. Так, глубокая гипотермия взрослых животных­ повышает концентрацию­ аммиака в 4,5 раза. Вместе с тем гипотермия не увеличивает концентрацию аммиака в мозге прозревающих­ сусликов, у которых количество­ его в состоянии нормотермии очень велико (2,68±0,15 мг %).

При гипотермии и гибернации­ уменьшается содержание­ лабильных амидных­ групп белков мозга, изменяется­ отношение их к прочносвязанным. Сопоставляя­ полученные результаты с изменением содержания аммиака, можно думать, что амидный азот белков является­ существенным источником­ аммиака в мозге у принудительно охлажденных и гибернирующих животных. Гипотермия увеличивает­ содержание мочевины у взрослых животных, напротив, концентрация мочевины в мозге при принудительном охлаждении снижается на 40,7 %, а при недельной и месячной зимней спячке на 28,2 и 67,7 %.

Характер изменения концентрации глютаминовой, аспарагиновой и аминомасляной кислот в мозге при понижении температуры тела дозревающих, месячных и взрослых сусликов отличается. Получен­ные результаты позволяют думать, что содержание γ-аминомасляной кислоты в мозге не определяет

состояния возбуждения или торможения. Так, при длительной спячке содержание γ-аминомасляной кислоты в ткани мозга гораздо ниже (15,0±0,59 мг %), чем при недельной спячке (42,9±2,1 мг %).

Параллельно проведенное определение содержания метаболитов углеводнофосфорного обмена (табл. 12) показало, что как при гипотермии, так и при гибернации в мозге сусликов сохраняется высокое содержание неорганического фосфора, КФ, АТФ, глюкозы и молочной кислоты (в мг %) в мозге малых сусликов различных возрастов в норме, при гипотермии (10 °С) и гибернации (10 °С).

У прозревающих и взрослых животных содержание КФ и АТФ заметно увеличивается, в то время как у месячных оно существенно не изменяется. Сходная динамика имеет место даже при глубокой гипотермии (25, 20 °С и ниже) у взрослых незимоспящих животных и объясняется усилением сопряженности дыхания и фосфорилирования.

Мы наблюдали при гипотермии некоторое увеличение количества глюкозы в мозге месячных (на 11,1 %) и взрослых (на 20,4 %) сусликов­. Возможно, это связано со снижением гликолитических процессов, о чем свидетельствует уменьшение содержания молочной кислоты. При недельной и 2-месячной зимней спячке концентрация глюкозы в ткани мозга повышается соответственно на 51,1 и 11 %.

Изменение содержания азотистых и углеводно-фосфорных мета­болитов головного мозга сусликов при их принудительном охлаждении­ в целом совпадает с изменением количества этих соединений при зимней спячке и близко

к изменениям азотистого и углеводно-фосфорного­ обмена мозга незимоспящих грызунов, адаптированных к холоду или перенесших пролонгированную гипотермию.

Под воздействием на организм низкой температуры, при терапии некоторых патологических состояний (кислородное голодание, шок, отравление и др.) возникает гипотермия, которая­ является физиологической при зимней спячке у животных. В последние 10–15 лет гипотермию искусственно вызывают при оперативных вмешательствах, а также для лечении некоторых болезней.

В то же время гипотермия вызывает расстройства и качественные­ нарушения обменных процессов организма.

Следовательно, выяснение особенностей обмена веществ, прежде всего особенностей метаболизма мозга, при гипотермии является одним из коренных пунктов проблемы искусственного охлаждения, одной из важнейших задач медицины сегодняшнего дня. Это необходимо для понимания основы физиологических процессов в центральной нервной системе при понижении температуры­ тела и, следовательно, для рационального использования­ этого метода в биологии и медицине.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 59

Интерес к этим вопросам, с нашей точки зрения, неизбеж­но приводит

кнеобходимости биохимического изучения головного­ мозга при адаптации

кохлаждению, холоду, а также при «природных экспериментах» – явлений природной адаптации к низким температурам, наиболее уникальным из которых следует­ считать зимнюю спячку млекопитающих.

Таблица 12

Содержание неорганического фосфора, КФ, АТФ, глюкозы и молочной кислоты (в мг%) в мозге малых сусликов

различных возрастов в норме, при гипотермии и гибернации (10°)

3.8. ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ НА ДИНАМИКУ АЗОТИСТЫХ МЕТАБОЛИТОВ МОЗГА У АДАПТИРОВАННЫХ К ХОЛОДУ КРЫС

Определяли содержание аммиака, глутамина, глутами­новой, аспарагиновой и гамма-аминомасляной аминокислот в головном мозге адаптированных к холоду (0–20 °С) крыс, при снижении ректальной температуры до 30, 25

и20 °С. В зависимости от глубины гипотермии содержание аммиака­ и глутамина в мозге увеличивается, концентрация аспарагиновой,­ глутаминовой

игамма-аминомасляной аминокислот изменяется несущественно.