Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

Глава 3.

Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии

на метаболизм мозга

Для раскрытия механизма нейрохимических реакций влияния принудительной гипотермии гомойотермного животного важно не только использование современных методов физико-химическго анализа, но и применение широкого спектра постановки экспериментов. Например, значительный вклад в проблему раскрытия как патологических, так и резервных, компенсаторных нейрохимических процессов влияния низкой температуры тела вносит такая постановка экспериментов, как исследование по мере углубления гипотермии, пролонгирования гипотермии, последующего самосогревания животных, в различные периоды по достижении нормотермии т.д. Большой интерес представляет постановка экспериментов с учетом различных возрастов, адаптации к низкой температуре тела и т.д.

Широкое использование различных подходов в эксперименте позволяет лучше оценить результаты биохимического анализа.

С учетом вышеизложенного, в данной работе приводится целый ряд исследований сотрудников нашей научной школы с оригинальной постановкой экспериментов.

3.1. Влияние кратковременной и пролонгированной гипотермии

на азотистый и углеводно-фосфорный метаболизм мозга гомойотермных и гетеротермных животных

Изучена динамика содержания азотистых и углеводно-фосфорных метаболитов в больших полушариях мозга ненаркотизированных белых крыс и малых сусликов в норме,­ при кратковременной и пролонгированной в течение 3 ч искусственной гипотермии (температура тела 30 и 20 °С).

Содержание большинства исследованных метаболитов в мозге нормотермических крыс и сусликов в июне–июле одинаково. Концентрация аммиака (0,5±0,03 мкМ/г) и глюкозы (3,4±0,03 мкМ/г) в мозге сусликов, соответственно, на 66,7 и 247 % выше, чем в мозге крыс. Содержание глюкозы в мозге сусликов

составляет более половины от ее уровня в крови, а у крыс –1,5.

Кратковременное охлаждение до 30 °С увеличивает содержание аммиака

вмозге крыс и сусликов, соответственно, в 7,0 и 4,6 раза. Одновременно в мозге

крыс достоверно­ уменьшается количество глюкозы, АТФ, креатинфосфата и в 1,7 раза увеличивается­ содержание лактата, что, очевидно, свидетельствует о гипоксии. По-видимому,­ гамма-аминомасляная кислота при этом используется как энергетический субстрат, что приводит к понижению ее концентрации с 2,1±0,06 до 0,6±0,02 мкМ/г. У сусликов в этих условиях содержание макроэргических фосфатов и глюкозы увеличивается, количество­ лактата не изменяется. При пролонгировании гипотермии 30 °С в течение 3 ч, а также при кратковременной и пролонгированной гипотермии 20 °С количество аммиака,­ макроэргических фосфатов, неорганического фосфора, а у крыс и глюкозы,

внесколько­ раз превышает те же показатели в контроле. Источником фосфора, возможно, являются фосфолипиды мозга. Образующиеся при этом жирные кислоты могут играть резервную роль как дополнительный источник энергии. Содержание глюкозы в крови и мозге сусликов при пролонгировании гипотермии 30 и 20 °С снижается по сравнению с контролем на 32–45 %.

Количество глутамина в мозге сусликов при всех исследованных состояниях выше, чем в мозге крыс, а содержание аспарагиновой, глутаминовой и особенно гамма-аминомасляной­ кислот значительно стабильнее. Это свидетельствует о том, что сбалансированность процессов их синтеза в мозге зимоспящих животных в меньшей мере нарушается при гипотермии.

3.2. АЗОТИСТЫЙ МЕТАБОЛИЗМ МОЗГА СУСЛИКОВ В НОРМЕ И ПРИ ГИПОТЕРМИИ В ПОСТНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ

Система регулирования содержания аммиака в мозге формируется в онто-

ифилогенезе. В мозге новорожденных и молодых животных­ оно гораздо выше, чем у взрослых.

Терморегуляция у зимоспящих животных развивается сравнительно­ поздно. Способность новорожденных и молодых сусликов переносить­ глубокую

идлительную гипотермию намного превышает выносливость­ в этом отношении других млекопитающих, в том числе и зимоспящих.

Поэтому определенный интерес представляет изучение азотистого обмена

мозга сусликов при гипотермии в постнатальном развитии.

Эксперименты проведены на двухнедельных, месячных и взрослых сусликах малых­ (Citellus pygmaeus Pall.), отловленных в поле (Дагестан). Зверьков содержали в виварии при температуре 20–22 °С. В этих условиях у 14-дневных сусликов ректальная­ температура равнялась 23–27 °С, у месячных – 34–35, у взрослых – 37–38 °С.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 43

Чтобы вызвать охлаждение животных, их помещали в холодильник. Ректальную температуру снижали до 10 °С.

Внужный момент животным быстро отсекали голову, которая падала

всосуд с жидким азотом. В замороженном виде извлекали мозг (без мозжечка) и растирали в ступке при постоянном замораживании. Белки осаждали 5 %-ным раствором трихлоруксусной­ кислоты (ТХУ) на холоде. После 20-ми- нутной экстракции и центрифугирования в надосадочной жидкости определяли содержание свободного аммиака, глутамина.

Чтобы очистить от липидов, осадок суммарных белков мозга промывали органическими­ растворителями. Белки высушивали в термостате при 37 °С и определяли в них сумму амидных групп и их лабильную и прочносвязанную фракции. Для этого белки гидролизовали в 1Н растворе серной кислоты на водяной бане при 100 °С в течение 10 мин и 2 ч. О содержании амидных групп судили по количеству азота аммиака в гидролизате.

У двухнедельных сусликов сумма амидных групп белков головного мозга уменьшается на 18,2 %, причем­ содержание лабильных амидных групп снижается на 39,7 %, а прочносвязанных – увеличивается на 26 %.

К месячному возрасту содержание аммиака в мозге сусликов сни­жается, содержание γ-аминомасляной кислоты – увеличивается по сравнению с прозревающими зверьками (табл. 2). Соотношение лабильных­ амидных групп и прочносвязанных колеблется в пределах 1,86–1,06 (табл. 3).

При гипотермии в 10 °С содержание аммиака и глутамина в мозге месячных сусликов увеличивается. Наблюдается некоторая тенденция к увеличению содержания глутаминовой кислоты. Уровни γ-аминомасляной и аспарагиновой кислот остаются без изменения.

Таблица 2 Содержание азотистых метаболитов в мозге сусликов различного возраста в норме и при гипотермии 10 °С (в %, средние данные 8–10 опытов, М±m)

В отличие от прозревающих месячные суслики на искусственное снижение температуры тела реагируют перегруппировкой амидных групп белков мозга,

причем суммарное содержание их остается без измения (табл. 3).

Таблица 3 Содержание амидных групп в суммарных белках мозга сусликов

различного возраста в норме и при гипотермии 10 °С

(в мкг на 1 мг сухого белка, средние данные 8–10 опытов, M±m)

Вследствие гипотермии у взрослых сусликов в ткани мозга резко увеличивается содержание аммиака, глутамина и аспарагиновой кислоты­. Содержание глутаминовой кислоты при этом стабильно, а концентрация­ γ-аминомасляной кислоты несколько снижается.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что изменения азотистого метаболизма мозга при гипотермии прозревающих, месяч­ных и взрослых сусликов имеют различный характер. Общим является то, что во всех случаях наблюдается накопление аммиака. У 14-дневных­ зверьков, когда содержание аммиака в мозге высокое (2,68±0,150 мг %), искусственная гипотермия не приводит к дальнейшему увеличению его концентрации. К месячному возрасту, когда содержание­ аммиака в мозге составляет 1,64±0,067 мг %, гипотермия сопровождается­ его увеличением в 2,1 раза. У взрослых сусли-

ков в результате­ гипотермии содержание аммиака в мозге увеличивается в 4,5 раза. Видимо, сохранение высокого содержания аммиака в ткани мозга свидетельствует об определенной его роли в преодолении экстремального­ состояния.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 45

3.3. ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МОЧЕВИНЫ

ВМОЗГЕ СУСЛИКОВ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТОВ

ВНОРМЕ И ПРИ ГИПОТЕРМИИ

Содержание мочевины в мозговой ткани довольно высоко: 1 г влажной ткани содержит 4–5 мкМ этого вещества­. Материалы ряда авторов из лабораторий З. С. Гершеновича и Г. Х. Бунятяна убеждают в наличии нескольких­ путей активного синтеза мочевины в мозге. Это косвенно свидетельствует о необходимости мочевины­ для функции мозга. Об активной биологической роли мочевины свидетельствуют прямые исследования: мочевина­ изменяет третичную структуру белка и влияет на активность ферментов, в присутствии мочевины изменяется оптимум рН действия пепсина. Мочевина способна­ образовывать комплексы с аминокислотами и другими­ компонентами клетки при помощи слабых и прочных­ связей.

При гипотермии теплокровного животного мочевина играет защитную роль. Очевидно поэтому­ при адаптации организма к гипотермии содержание мочевины в мозге подвергается резким изменениям. По нашим исследованиям,­ концентрация мочевины о тканях мозга изменяется и при зимней спячке в зави­ симости от температуры тела спящего животного и длительности­ гибернации.

Азотистый метаболизм в мозге формируется в онто- и филогенезе. Терморегуляция у зимоспящих животных развивается­ сравнительно позд-

но. Способность­ новорожденных и молодых сусликов переносить глубокую и длительную гипотермию намного превышает выносливость в этом отношении других млекопитающих, в том числе и зимоспящих.

В связи с этим представляет интерес исследовать изменения содержания мочевины в мозге у развивающихся­ сусликов в норме и при принудительном охлаждении­.

Эксперименты проведены на двухнедельных, месячных­ и взрослых сусликах малых (Citellus pygmaeus Pallas), отловленных в мае 1968 года в поле (Дагестан). Зверьков содержали в виварии при температуре 20–22 °С. В этих условиях у 14-дневных сусликов ректальная­ температура равнялась 23–27 °С, у месячных – 34–35 °С, у взрослых – 37–38 °С.

Чтобы вызвать охлаждение животных, их помещали в холодильник. Ректальную температуру снижали до 10 °С.

Внужный момент животным быстро отсекали голову,­ которая падала

всосуд с жидким азотом. В замороженном­ виде извлекали мозг (без мозжечка) и растирали­ в ступке при постоянном замораживании. Белки осаждали 5 %-ным раствором трихлоруксусной кислоты на холоде. После 20-минутной экстракции и центрифугирования­ в надосадочной жидкости определяли содер­ жание мочевины уреазным методом. Определяли образовавшийся аммиак.

По результатам наших исследований содержание сво­бодной мочевины в мозге двухнедельных (прозревающих)­ сусликов составляет

3,55±0,090 мкМ/г.

Таблица 4 Содержание мочевины в мозге сусликов различного возраста

в норме и при гипотермии 10 °С

Упрозревающих сусликов, охлажденных до 10 °С, содержание­ мочевины

вмозге увеличивается на 35,7 % (Р<0,001).

К месячному возрасту количество мочевины в мозге сусликов не подвергается особому изменению (3,61±0,181 мкМ/г).

При гипотермии в 10 °С содержание мочевины в мозге­ месячных сусликов увеличивается на 56,5 %. Дальнейшее самосогревание же месячных зверьков снижает количество мочевины в мозге до 2,55±0,229 мкМ/г (70,6 %

от нормы).

В мозге взрослых бодрствующих в мае сусликов содержание­ мочевины наиболее высоко: 60,5±0,298 мкМ/г. Вследствие гипотермии у взрослых зверьков в ткани мозга содержание мочевины снижается на 40,7 %.

Сопоставление полученных результатов с данными параллельно прове-

денных в нашей лаборатории экспериментов показывает, что между биосинтезом моче­вины и нейтрализацией аммиака в ткани мозга нет взаимосвязи. Полученные результаты, видимо, свидетельствуют­ об определенной роли мочевины в мозге в преодолении экстремального состояния. Можно думать,­ что

содержащаяся в мозговой ткани мочевина в зависимости от ее концентрации способна влиять на структуру белков и обеспечивать определенную конфор­ мацию их молекул. Возможно, что взаимоотношения различных путей биосинтеза мочевины в мозге и степень­ ассоциированности ее с белками изменяются в онтогенезе­.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 47

3.4. АНАЭРОБНЫЙ И АЭРОБНЫЙ ГЛИКОЛИЗ В ТКАНИ МОЗГА СУСЛИКОВ И КРЫС

РАЗЛИЧНОГО ВОЗРАСТА ПРИ ГИПОТЕРМИИ

Мозг зимоспящих и молодых незимоспящих животных в норме характе­­ ризуется­ сниженным эффектом Пастера, умеренная гипотермия (30–28 °С) не приводит к достоверному изменению гликолиза в срезах больших полушарий мозга сусликов. При глубокой искусственной гипотермии (10 °С) анаэробный

иаэробный гликолиз в ткани мозга снижается соответственно на 82 и 71 %, а при зимней спячке (10 °С) – на 72 и 71 %. Четкой зависимости между возрастом и степенью снижения гликолиза в мозге крыс различного возраста при гипотермии не найдено.

Ранее было изучено влияние гипотермии на дыхание мозга зимоспящих­

имолодых незимоспящих животных, которые, как известно, способны переносить значительно более глубокое охлаждение, чем взрослые гомойотермные животные.

Целью нашего исследования явилось изучение анаэробного и аэробного гликолиза в ткани мозга сусликов и крыс различного возраста­ в норме и при охлаждении.

Опыты по искусственной гипотермии проведены в мае–июне на ненарко­ тизиро­ванных­ взрослых сусликах (Citellus pygmaeus Pall.) и белых крысах четырех групп: новорожденных, прозревающих (13–16 дней), месячных и взрослых (6–9 месяцев).

Неполовозрелых животных охлаждали до ректальной температуры 10 °С, взрослых­ крыс – до 20–18 °С, сусликов – до 30–28 °С, 20–18 °С и 11–10 °С. Контролем служили нормотермические (37 °С) животные того же возраста.

Вотдельных опытах исследовали гликолитические процессы в ткани мозга сусликов при недельной зимней спячке (10 °С). Контролем служили бодрствующие (35–37 °С) зимой животные, содержащиеся в обычных условиях вивария.

Определяли интенсивность анаэробного гликолиза в срезах коры больших полушарий мозга. Об интенсивности аэробного гликолиза судили по возраста­ нию содержания молочной кислоты за время инкубации срезов в фосфатносолевом буфере с глюкозой в аэробных условиях. Инкубацию проводили при 37, 28, 20 и 10 °С.

Анаэробный и аэробный гликолиз в ткани мозга крыс при нормотермии­ к месяцу постнатальной жизни усиливается по сравнению с однодневными животными соответственно на 111 и 148 % (табл. 5). У взрослых животных интенсивность аэробного гликолиза снижается до уровня этого процесса у новорожденных и прозревающих крысят, а анаэробное образование молочной кислоты усиливается по сравнению с месячными животными на 18 % (р<0,05).

Охлаждение крыс приводит к статистически достоверному (р<0,05) ослаблению интенсивности как анаэробного, так и аэробного гликолиза в ткани

мозга (инкубация срезов при температуре, равной температуре тела животных). Прямой зависимости между возрастом и степенью снижения гликолиза в ткани мозга крыс при гипотермии в отличие от дыхания не найдено. Интересно, что интенсивность гликолитических­ процессов сильнее угнетается при снижении температуры инкубации срезов мозга нормотермических животных (особенно месяч­ных и взрослых), нежели при охлаждении целого организма до той же температуры. Это свидетельствует о том, что снижение интенсивности гликолиза в ткани мозга при охлаждении целого организма не может быть сведено

кодному лишь прямому действию температуры на активность­ гликолитических ферментов согласно закону Вант-Гоффа, а обусловлено другими механизмами, регулирующими течение энергетических­ процессов в головном мозге.

Сповышением температуры инкубации срезов до 28 и 37 °С аэробный­ гликолиз срезов мозга при гипотермии у крыс всех групп резко усиливается и в 1,5–2 раза превышает уровень этого процесса у нормотермических­ животных.

Анаэробный гликолиз в ткани мозга гипотермических неполовозрелых­ крыс при этом почти полностью нормализуется. У взрослых животных процесс нормализации выражен хуже.

Сравнение интенсивности анаэробного и аэробного гликолиза в ткани мозга взрослых зимоспящих и незимоспящих нормотермических животных показывает, что скорость образования молочной кислоты срезами мозга сусликов в анаэробных условиях на 36 % ниже, чем в мозге крыс. Аэробный гликолиз, напротив, более интенсивен (на 71 %) в ткани мозга зимоспящих животных. В зимний период интенсивность гликолиза в мозге нормотермических­ сусликов но сравнению с летом не изменяется, а интенсивность­ анаэробного гликолиза уменьшается в 1,6 раза.

Высокий уровень аэробного гликолиза при относительно низкой ин­ тенсивности анаэробного образования молочной кислоты свидетельствует­ о сравнительно слабом эффекте Пастера в мозге зимоспящих животных, особенно в зимний период.

Низкий эффект Пастера наблюдался в наших опытах и у неполовозрелых­ крыс (табл. 5), в то время как у взрослых животных он хорошо выражен. Следует отметить, что эффект Пастера снижался в ткани мозга адаптирован-

ных к охлаждению гомойотермных­ животных и у тех взрослых крыс, жизнь которых при глубокой гипотермии удавалось сохранять.

Таким образом, оказалось, что пониженный эффект Пастера в ткани мозга свойственен животным (зимоспящим, новорожденным и адаптированным

кхолоду взрослым крысам), способным сравнительно легко переносить глубокую гипотермию.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 49

Таблица 5 Анаэробный и аэробный гликолиз в срезах ткани больших полушарий

мозга крыс различного возраста в норме и при глубокой гипотермии (в мкмолях молочной кислоты на 1 г влажной ткани за 1 ч; n = 8–10; М±m)

Примечание. В скобках – интенсивность гликолиза в ткани мозга и нормотермических крыс при снижении температуры инкубация срезов до температуры тела гипотермических животных.

На начальных этапах (30–28 °С) охлаждения зимоспящих животных­ интенсивность анаэробного и аэробного гликолиза, определенная при температуре тела, существенно не отличалась от контроля (табл. 6). Полученные результаты соответствуют нашим прежним данным относительно неизменности содержания молочной кислоты в ткани мозга­ сусликов в условиях умеренной гипотермии. У ненаркотизированных при умеренной гипотермии резко повышается анаэробный (на 25,6 %), так и аэробный (на 18,7 %) гликолиз в срезах мозга.

Под влиянием глубокой искусственной гипотермии (10 °С) у сусликов­ в ста-

дии так называемого «холодового наркоза» интенсивность анаэробного и аэробного гликолиза мозга ослабляется соответственно на 82 и 71 %. Примерно в такой же мере у них снижается скорость анаэробного­ (на 72 %) и аэробного (на 71 %) образования молочной кислоты­ при недельной зимней спячке (10 °С).

С повышением температуры инкубации срезов мозга гипотермических­ животных до 28 и 37 °С интенсивность анаэробного образования молочной

кислоты в мозге сусликов, как и у неполовозрелых крыс, значительно возрастает и либо превосходит уровень контрольных животных,­ либо равна ему.

Таблица 6 Анаэробный к аэробный гликолиз в срезах ткани больших полушарий мозга сусликов в норме, при гипотермии и недельной зимней спячке

(в мкмолях молочной кислоты на 1 г влажной ткани за 1 ч; n=8–10)

Аэробный гликолиз срезов мозга гипотермических сусликов с повышением­ температуры инкубации срезов до 37 °С достигает уровня нормотермических зверьков, но в отличие от крыс не превышает­ его.

Полученные результаты свидетельствуют о существенных различиях­ в динамике гликолитических процессов, протекающих в ткани мозга сусликов и взрослых крыс, и вместе с тем об определенном сходстве­ в этих процессах между зимоспящими и молодыми незимоспящими­ животными, что, повидимому, связано с их большей холодовой резистентностью.

3.5. ДИНАМИКА γ-АМИНОМАСЛЯНОЙ, ГЛУТАМИНОВОЙ И АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТ МОЗГА ПРИ МНОГОКРАТНОЙ ГИПОТЕРМИИ И ПОСЛЕДУЮЩЕМ САМОСОГРЕВАНИИ

Приспособление организма к измененным условиям существовании ста-

новится возможным благодаря наличию соединений, стоящих на стыке путей метаболизма. В системе переработки информации действуют­ обратные связи, регулирующие скорость и направление пути системы­. Такими свойствами обладает система глутамат – γ-аминомасляная кислота и сопряженные с ней превращения. Наши предыдущие исследования показали, что гипотермия создает в мозге чрезвычайные ситуации, которые выражаются в нарушении