Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 71

как агрегации, так и фрагментации. Процессы­ агрегации белков при этом связывают с образованием между ними битирозиновых сши­вок, что препятствует регистрации карбонильных­ групп. Показано, что окисленные белки зна­ чительно быстрее подвергаются протеолизу, чем в результате чего образуются низкомолекулярные­ олигопептиды. По-видимому, ускорение процессов агрегации, фрагментации и протеолиза окислительно-модифицированных белков и является причиной снижения регистрируемого­ количества карбонильных групп в белках­ при гипотермии 20 °С.

Таблица 16 Содержание карбонильных групп (нмоль/мг белка) в белках плазмы крови

крыс при гипотермии и введении даларгина (М±m; n=6–8)

Примечание. р<0,05: * – по сравнению с контролем,+ – по сравнению с гипотермией 30 °С.

Введение даларгина контрольным животным не влияет на исходное содержание карбонильных­ групп в белках, однако незначительно, но достоверно снижает их накопление в модельной системе. Даларгин оказывает слабое за­ щитное воздействие при умеренной гипотермии, однако при пролонгированной умеренной и глубокой­ гипотермии введение даларгина оказывается совершенно неэффективным.

Низкий антиоксидантный защитный эффект даларгина в отношении белков плазмы крови при умеренной гипотермии и его полное отсутствие­ при удлинении ее сроков, по-видимому,­ связаны с тем, что он быстро (за

7–13 мин) расщепляется в плазме крови протеолитически­ми ферментами. Кроме того, в использован­ной нами концентрации этот пептид не оказы­вает непосредственного антиоксидантного дейст­вия. Основным эффектом даларгина считается предотвращение им стрессорной активации катаболических процессов и связанной с этим генерации­ АФК. Свое действие даларгин реализует­

через взаимодействие со специфическими рецепторами на мембране клеток

различных тканей,­ в том числе клеток крови. На степень окислительной модификации белков плазмы при гипотермии даларгин, по-видимому, может ока­ зать лишь опосредованное влияние путем предотвращения­ накопления АФК и устранения утечки окисленных белков и прооксидантов из клеток и тканей в плазму крови.

Таким образом, умеренная гипотермия, в особенности пролонгированная, существенно ускоряет окислительную модификацию белков, а введение даларгина при этом не дает существенного защитного эффекта.

3.12. ВЛИЯНИЕ ДАЛАРГИНА НА СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВЫХ И ЛИПИДНЫХ КОМПОНЕНТОВ ПРИ ГИПОТЕРМИИ

Падение температуры тела для строгих гомойотермов является чрезвычайной ситуацией. Развивающийся­ при этом холодовой стресс активирует гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему, в результате­ чего резко усиливаются синтез и секреция катехоламинов и глюкокортикоидов. Под действием­ этих гормонов ускоряются процессы мобилизации депонированных липидов и гликогена, их утилизация в тканях. Об активации катаболических процессов­ в тканях на начальных этапах свидетельствуют­ результаты, полученные при исследовании­ содержания липидных, углеводных и белковых компонентов в крови и тканях.

Впоследние годы получены убедительные данные,­ свидетельствующие

оспособности опиоидных пептидов, в частности аналога лей-энкафалина гексапептида даларгина, препятствовать развитию стресса и стрессорной активации метаболических процессов. Даларгин уменьшает избыточный синтез и секрецию­ ряда гормонов, участвующих в реализации стресса, а также стабилизирует биохимический состав крови. Можно ожидать, что стабилизирующее влияние на биохимический состав крови даларгин окажет и в условиях гипотермического стресса.

Вданной работе исследовано содержание общего белка, альбумина, мочевины, холестерина и триглицеридов в сыворотке крови крыс при гипотермии разной­ глубины и в ближайшем постгипотермическом периоде, а также выяснена возможность регуляции их содержания путем введения даларгина.

Работа выполнена па беспородных крысах-самцах массой 170–200 г. Гипотермию вызывали наружным охлаждением животного, снижая температуру тела до 30 и 20 °С. Животных исследовали через 1 и 7 суток после перенесенной гипотермии 20 °С. Даларгин вводили­ внутрибрюшинно (доза 100 мкг/кг массы) за 30 мин до холодового воздействия. Данная доза является оптимальной для проявления ряда биологических эффектов­. Контрольным животным

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 73

вводили соответствующий­ объем физиологического раствора. В сыво­ротке крови определяли общее содержание белка, альбумина, мочевины, холестерина и триглицеридов на биохимическом анализаторе «Ультра-906» фирмы «Коне» (Финляндия) с использованием соответствующих­ тест-наборов (табл. 17).

Как видно из таблицы 17, при умеренной гипотермии обнаруживается тенденция к снижению содержания общего белка и альбумина (ОБА) в сыворотке крови, что, видимо, связано с усилением их распада, выходом­ из сосудистого русла в результате увеличения проницаемости стенок сосудов.

При дальнейшем снижении температуры тела (20 °С) ОБА повышается до контрольного уровня.

Таблица 17 Содержание белковых и липидных компонентов в сыворотке крови крыс

при гипотермии и введении даларгина (M±m; n=6–12)

Примечание. * – достоверные (Р<0,05) различия относительно контроля, ** – относительно соответствующего уровня гипотермии­ без введения даларгина.

Через сутки после перенесенной гипотермии 20 °С количество ОБА достоверно снижается, что в основном связано с торможением его синтеза и частично за счет усиления распада. К концу первой недели после самосогревания содержание ОБА в сыворотке полностью нормализуется.

Даларгин, введенный контрольным животным за 30 мин до декапитации, не влияет на содержание ОБА, способствует его стабилизации при низких темпера­

турах, что, видимо, связано со способностью даларги­на регулировать осмотическое давление крови, улучшать­ гемо- и лимфоциркуляцию, предотвращать катаболические процессы.

Для состояния гипотермии характерно повышение уровня мочевины в крови и тканях. Нами также обнаружено повышение содержания мочевины в сыворотке­ крови при гипотермии, причем оно увеличи­вается с понижением температуры. Это

связано как с повышенным поступлением из тканей, так и со снижением­ скорости ее экскреции при низких температурах­ тела, о чем свидетельствуют ускорение протеолитических­ процессов и повышение активности аргиназы­ тканей, в особенности печени, а также существенное снижение клубочковой фильтрации.

В постгипотермическом периоде уровень мочеви­ны в сыворотке полностью нормализуется.

Введение даларгина существенно не изменяет содержание­ мочевины в сыворотке крови контрольных животных, не влияет на содержание мочевины и при гипотермии 30 °С. Однако при гипотермии 20 °С даларгин­ не только не предотвращает повышение содержание­ мочевины в сыворотке, но и способствует дальнейшему росту ее уровня. Возможно, что при глубокой гипотермии даларгин полностью прекращает­ экскрецию мочевины, поскольку наряду с существенным­ снижением клубочковой фильтрации проявляется­ и антидиуретический эффект пептида.

Исследование липидных компонентов показало, что при гипотермии существенно (в 2 и более раз) повышается содержание холестерина в сыворотке. Повышение в той или иной мере уровня общего холестерина­ в крови и увеличение доли его свободной формы были обнаружены и ранее.

Повышение содержания холестерина в сыворотке крови при гипотермии связано, с одной стороны, с существенным ускорением его синтеза в печени и поступлением в кровь, с другой – замедлением процесса его выведения из крови. Нельзя исключить­ поступление холестерина в плазму из мембран клеток. При гипотермии обнаружено снижение содержания холестерина в мембранах эритроцитов крыс.

Как видно из таблицы, изменения в обмене холестерина,­ возникшие в ходе

снижения температуры тела, не исчезают в постгипотермическом периоде. Оказалось, что через сутки после самосогревания содержание­ холестерина в сыворотке снижается относительно­ гипотермии, но еще полностью не нормализуется­. Однако через 7 суток после гипотермии содержание­ холестерина в сыворотке вновь увеличивается и в 2,5 раза превышает контрольный уровень.

Инъекция даларгина контрольным животным не оказывает влияния на содержание холестерина в сыворотке­ крови. В условиях низкой температуры тела даларгин препятствует повышению содержания холестерина­ в крови. При этом даларгин более эффективен­ при умеренной гипотермии.

Обнаружено, что однократная инъекция крысам с острой гиперхолестеринемией даларгина эффективно предотвращает возрастание уровня холестерина к крови. Гипохолестеринемическое действие даларгина­ авторы обнаружили у людей с облитерирующим атеросклерозом, получившим этот препарат. По данным, введение даларгина предотвращало повышение­ в крови крыс процентное содержание ЛПНП и ЛПОНП, возникшее при предварительной холесте­риновой нагрузке. Видимо, гипохолестеринемическое действие даларгин оказывает за счет снижения холестерина­ аэрогенных фракций липопротеидов.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 75

Наряду с холестерином при гипотермии возрастает содержание и триглицеридов. Так, у животных с температурой­ тела 30 °С их содержание в сыворотке возрастает­ на 66 %. При гипотермии 20 °С содержание триглицеридов снижается, но все же на 27 % превышает­ контрольный уровень. Нормализация уровня триглицеридов в сыворотке крови в постгипотермическом периоде нами обнаружена только на 7-е сутки.

Оказалось, что у контрольных животных даларгин заметно (23 %) снижает

всыворотке крови содержание­ триглицеридов. В условиях гипотермии даларгин

вопределенной мере препятствует их повышению.

Наиболее выраженное действие оказывает даларгин­ на содержание липидных компонентов крови, гиполипидемическое действие даларгина при экстремальных­ состояниях связывают с его способностью предотвращать стрессорное повышение содержали, катехоламинов и глюкокортикоидов в тканях и крови и устранять их периферические эффекты.

Таким образом, полученные нами результаты показывают,­ что особенно на начальных ее этапах, существенно­ изменяется содержание белковых и липидных­ компонентов в сыворотке крови. Нормализация­ их уровня, за исключением холестерина, происходит­ на 7-е сутки после самосогревания. Даларгин, введенный до начала снижения температуры тела, в основном предотвращает изменение биохимического состава крови, вызываемое гипотермией.

3.13. ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ НА ПОГЛОЩЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ

СРЕЗАМИ МОЗГА

Исследована интенсивность поглощения меченых С14-глутамата, аспартата, γ-аминомасляной кислоты, валина, гистидина и аминоизомасляной кислоты срезами мозга охлажденных (20 °С) крыс. Инкубация срезов мозга при 37 °С у охлажденных крыс не приводила к выраженным сдвигам по сравнению с нормотермическими животными. Инкубация срезов мозга гипотермических животных при 20 °С снижала интенсивность поглощения аминокислот по сравнению с инкубацией при 37 °С. Результаты показали, что соотноше­ние максимального поглощения аминокислот (за исключением аминоизомасляной кислоты и гистидина) при температуре инкубации срезов 37 °С и 20 °С у гипотермических­ крыс возрастало по сравнению с таковым у нормотермических животных. У охлажденных­ до 20 °С крыс поглощение каждой отдельной аминокислоты срезами мозга изменяется в различной степени в зависимости от времени инкубации (5, 10, 15 и 30 мин).

Аминокислоты в мозге играют полифункциональную роль. Содержание аминокислотного фонда в ткани мозга зависит от активности­ их транспорта и метаболизма. Компартментализация аминокислот определяется избирательным

транспортом и различной способностью клеточных структур поглощать аминокислоты. Установлено, что по транспортному механизму в срезах мозга аминокислоты делятся на 18 различных классов. Такое многообразие обусловлено длиной углеродной цепи, местом расположения и характером функциональных групп в молекуле аминокислот, а также ингибирующим влиянием их самих на поглощение из среды. Важной характеристикой транс­порта аминокислот в срезах мозга является установление равновесия их поглощения в динамике времени инкубации. Срезы мозга аккумулируют­ аминокислоты в зависимости oт присутствия К+, Na+ и содержания АТР. Для транспорта всех аминокислот характерна­ температурная зависимость. Общее охлаждение теплокровного­ организма приводит к значительному изменению в мозге энергетического обмена и аминокислотного фонда, что может сказаться на клеточном транспорте аминокислот в тканях мозга. В то же время ранее нами не был обнаружен эффект гипотермии на транс­порт аминокислот из циркулирующей крови в мозг.

Целью работы явилось изучение влияния глубокой гипотермии на поглощение аминокислот срезами мозга в зависимости от температуры и времени инкубации.

Эксперименты проведены на крысах линии Вистар массой 250–275 г. До начала опытов животным внутрибрюшинно в течение 30 мин вводили хлоралгидрат (380 мг/кг массы тела). Охлаждали крыс в ледяной­ воде. Температуру измеряли ректально и в среднем ухе, а после обезглавливания в самой ткани мозга. При пребывании в холодной воде­ 50–55 мин температура среднего уха и мозга снижалась до 20 °С, а ректальная при этом была на 2–3 °С ниже. Для опытов использовали­

только тех животных, у которых температура ткани мозга после декапитации­ равнялась 20 °С. В отдельной серии экспериментов в кровь ох­лажденных крыс вводили синюю краску. При температуре мозга, равной 20 °С, выход краски не наблюдался, следовательно, в данных условиях мозг механически не повреждался. Контрольных и подопытных крыс декапитировали, быстро извлекали мозг (без мозжечка), очищали от крови. Из обоих полушарий головного мозга готовили срезы (0,4 мм) при помощи микротома Мак-Ильвейна. Срезы инкубировали в среде, содержащей в мМ: NaCl – 119; KCl – 5,0; CaCl2 – 0,75; MgCl2 – 12; NaH2PO4 – 1,0; глюкозы – 10 и N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфаниловой кислоты – 25. Добавлением NaOH рН среды доводили­ до 7,35.

Инкубацию срезов мозга (140 мг ткани на 5 мл среды) проводили­ в водяной бане при 37 °С и 20 °С. Через 30 мин в среду добавляли меченые­ аминокислоты (0,05 мкКu/5 мл) фирмы «New England Nuclear» при конечной концентрации 1 мМ для L-аспартата, L-валина, D-глутамата, γ-аминомасляной кислоты, L-гистидина и 2 мМ для α-аминоизомасляной кислоты­. Выбор указанных аминокислот для исследования продиктован тем, что изучены динамическое равновесие, кинетические параметры и энергия­ активации поглощения этих аминокислот в срезах мозга

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 77

интактных животных. Все выбранные 5 аминокислот и аналог γ-аминомасляной кислоты α-аминоизомасляная кислота относятся к отдельным транспортным классам по длине углеродной цепи, месту расположения, характеру и количеству­ функциональных групп.

Для определения интенсивности поглощения аминокислот инкубацию­ срезов продолжали 5, 10, 15 и 30 мин. После инкубации срезы мозга фильтровали, замораживали с помощью сухого льда, взвешивали,­ гомогенизировали в 2 мл 3 %-ного раствора хлорной кислоты и через 15 мин центрифугировали. 0,5 мл надосадочной жидкости добавляли к 15 мл сцитилляционной жидкости и измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике Interlechnique SL 30, Teledyne (США). Величину­ поглощения аминокислот срезами мозга выражали в мкмоль меченых аминокислот, включенных в ткань мозга. Для вычисления внеклеточного­ пространства использовали С14-карбоксиинулин. В параллельных­ опытах с добавлением немеченого инулина определяли содержание­ воды высушиванием срезов при 95 °С (48–72 ч) до постоянного­ веса.

Таблица 18 Поглощение меченых аминокислот (мкмоль/мл внутриклеточной жидкости) срезами мозга крыс, охлажденных до 20 °С (n=6; время инкубации 30 мин)

Результаты, приведенные в табл. 18, показали, что поглощение ами­нокислот в срезах мозга контрольных нормотермических крыс значительно­ снижалось при температуре инкубации 20 °С по сравнению с таковым при 37 °С, что совпадает с литературными данными. Наибольшее­ снижение поглощения наблюдалось для аминоизомасляной кислоты­ – 9,3, γ-аминомасляной кислоты – 2,2, гистидина­ – 2,7 раза.

Представляло интерес изучение поглощения указанных аминокислот­ срезами мозга крыс, предварительно охлажденных до 20 °С. Проведенные­ исследования показали, что у охлажденных до 20 °С крыс поглощение­ аминокислот срезами мозга при инкубации 37 °С не подвергалось выраженным сдвигам по сравнению с нормотермическими животными. Примечательно, что инку-

бация срезов мозга гипотермических животных­ при 20 °С также приводила

к снижению интенсивности поглощения по сравнению с инкубацией при 37 °С. Из опытов следует, что интенсивность­ поглощения аминокислот при 20 °С, за исключением аминоизомасляной­ кислоты и гистидина, у гипотермических животных снижалась значительно больше, чем у нормотермических животных. Наибольшее снижение поглощения в срезах гипотермических животных при температуре­ инкубации 20 °С по сравнению с таковым при 37 °С наблюдалось для аминоизомасляной кислоты – в 4,6, γ-аминомасляной кислоты – 4, гистидина – 2,9, глутамата­ и аспартата – 2 раза.

Мы вычисляли соотношение поглощения аминокислот срезами мозга у нормо- и гипотермических крыс (табл. 19) при температуре инкубации­ 37 °С и 20 °С. Оказалось, что за исключением аминоизомасляной кислоты и гистидина для всех аминокислот у нормо- и гипотермических крыс при температуре инкубации 20 °С оно было гораздо выше, чем при 37 °С.

Таблица 19 Соотношение поглощения аминокислот срезами мозга у нормо- и гипо­

термических (20 °С) крыс при температуре инкубации 37 и 20 °С (время инкубации 30 мин)

При этом из сильнокислых аминокислот в большей степени повышалось соотношение поглощения аспартата. Видимо, охлаждение­ организма изменяло транспортную систему аминокислот, связанную­ с длиной углеродной цепи, что приводило к снижению сродства поглощения аминокислоты с короткой углеродной цепью. Значительно увеличилось при температуре инкубации 20 °С соотношение поглощения γ-аминомасляной кислоты у нормо- и гипотермических крыс. В то же время степень повышения этого соотношения для валина была гораздо ниже, чем для γ-аминомасляной кислоты (табл. 19). По-видимому, снижение температуры тела оказывало неодинаковый эффект, а транспортный механизм нейтральных­ аминокислот (γ-аминомасляной кислоты и валина). В литературе имеются сведения о том, что на транспортную систему аминокислот влияет место расположения­ аминогруппы в ее молекуле. Соотношение поглощения аминокислоты с гетероциклической цепью – гистидина срезами мозга при температуре инкубации 20 °С у нормо- и гипотермических крыс увеличивалось­ незначительно

(на 0,07) по сравнению с таковым при температуре­ инкубации 37 °С.