Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

стороны эффект глюкозы на образование­ глутамата и глутамина, а с другой – распад глутамина с освобождением аммиака. γ-аминомасляная кислота принимает участие в нейтрализации­ аммиака в мозге и синтезе мочевины. Недавно найденный аргиназный путь образования мочевины в мозге не является единственным. Активность аргиназы мозга невелика и не может обеспечить образование обнаруженной в ней большой­ концентрации мочевины.

В лаборатории З. С. Гершеновича [12] на срезах мозга крыс установлено­ прямое участие γ-аминомасляной кислоты в связывании­ аммиака к образованием мочевины. Устранение аммиака синтезом мочевины через γ-аминомасляную кислоту в нервной ткани на основании опытов с мечеными соединениями мало интенсивно­.

Таким образом, метаболизм глутаминовой кислоты обеспечивает­ быстрое образование и устранение аммиака в мозге.

Было высказано предположение о том, что в процессах связывания и освобождения аммиака в мозге велика роль белков. Затем было экспериментально доказано, что свободные карбоксильные группы белков могут связывать свободный аммиак, а амидные группы могут легко подвергаться процессу дезамидирования с образованием свободного аммиака.

«Так как концевая карбоксильная группа белковой молекулы­ в ткани может легко отщеплять и связывать аммиак, так и как концевые группировки белка и его внутримолекулярные структурные элементы обмениваются на соединения, имеющиеся в растворе без участия катализаторов, то возникло предположение,­ что “взрывоподобное” освобождение аммиака объясняется­

именно обменными реакциями в белковых системах» [23].

З. С. Гершеновичем, А. А. Кричевской [10] было предположено, что часть амидного азота белка играет какую-то специфическую роль в процессах амидирования и дезамидирования белков головного мозга.

Это предположение обосновано и тем, что в мозге найден фермент, катализирующий обратимое амидирование и дезамидирование­ белков мозга.

Установлено, что амидные группы белков мозга обладают различной прочностью [10]. Наиболее­ легко гидролизуется амидная группа глутамина. Для ее отщепления достаточно 10 мин кипячения в 1H серной кислоте. Значительно более устойчива амидная группа аспарагина. Ее отщепление в тех же условиях происходит за 2–3 часа. В состав­ белка могут входить амиды и других аминокислот.

Оказалось, что в зависимости от функционального состояния­ центральной нервной системы количество амидных групп белков мозга изменяется. При истощающем мышечном утомлении белки мозга дезамидируются, при отдыхе они вновь амидируются. При исследовании суммарных и водорастворимых белков мозга в разные фазы кислородного отравления [23] были получены материалы­

о разном соотношении в них амидных и карбоксильных групп. В суммарных

белках в судорожную фазу общее количество­ амидных групп возрастает, а карбоксильных – уменьшается­. Существенно и по-разному меняется соотношение между легкогидролизуемыми (лабильными) и прочносвязанными амидными­ группами в водорастворимых и суммарных белках мозга.

Исследования показывают, что при кислородном голодании процессы дезамидирования белков в мозге усиливаются, приводя­ к накоплению в значительных количествах аммиака.

По-разному, количественно и качественно, изменяется динамика­ амидных групп белков мозга при воздействии возбудителей­ гормонов, при поражении проникающей радиации, при опухолевом росте, при действии импульсных ускорений [7, 11].

Следовательно, освобождение и связывание аммиака, столь характерные для деятельности нервных клеток, сопряжены с амидированием и дезамидированием белков.

Степень амидированности и участие в аммиакообразовании разных фракций белков мозга при различных функциональных состояниях не одинаковы [10]. Последнее является­ одной из молекулярных основ специфических функций белков, ткани, органа. В связи с этим представляется перспективным­ выявление наиболее ответственных в этом отношении белковых фракций и индивидуальных белков.

Источником аммиака могут быть и другие соединения, в состав­ которых входят аминные группы. К ним относятся нуклеиновые кислоты, азотсодержащие липиды, аминосахара, никотинамидадениндинуклеотиды и др.

Исследования П. А. Кометиани [23] показали,­ что в процессе утомления животного имеет место уменьшение содержания азота липидов мозга, а аэробное инкубирование срезов в присутствии глюкозы или оксалацетата сопровождается увеличением содержания амидного азота в липидах­ и его снижением в белках. Следовательно,­ липиды также могут связывать аммиак. Вопрос о том, какие именно липиды участвуют в освобождении и устранении аммиака­ в мозге, остается открытым.

Синтез и распад глюкозамина в мозговой ткани являются частью системы освобождения – связывания аммиака и вовлечения­ углеводов в этот характерный для функции мозга процесс [10].

Ряд авторов указывают еще на неизвестный источник образования аммиака в мозге при различных функциональных состояниях [23].

Таким образом, цитированные и обсужденные материалы показывают,­ что процесс образования и связывания аммиака, тесно связанный с функциональной активностью нервной ткани, является интегральной частью комплекса биохимических реак­ций, лежащих в основе процессов, протекающих в цен-

тральной нервной системе в связи с ее специфической деятельностью.

глава 1. Азотистый обмен мозга

при охлаждении животного

Внастоящее время накоплен достаточно большой фактический­ материал об обмене аммиака при гипотермии.

В40-х годах ХХ столетия ученые наблюдали накопление аммиака в замороженной нервной ткани животных. При этом освобождение аммиака заморо­ женным нервом немного опережало интенсивность его выделения­ при других видах раздражения. При электрическом раз­дражении накопление аммиака превышало аммиакообразование покоящимся нервом лишь в 3,3 раза, при химическом и осмотическом­ – в 2,5–4,4 раза, механическом – в 3,0–3,7 (максимально в 15,7) раз. Исключительную интенсивность аммиакообразования­ при замораживании объясняли тем, что возбуждение при этом является производным нескольких одновременно действующих мощных факторов [39]. Делается заключение, что «обильное отделение аммиака при замораживании­ нельзя

вдальнейшем не принять в расчет при изучении химизма анабиоза и парабиоза от охлаждения».

Однако эти данные не привлекли должного внимания экспериментаторов­. Процесс образования аммиака в нервной ткани и головном мозге при охлаждении животного долгое время не исследовался­. Лишь в 60-х годах ХХ столетия появились сведения о содержании­ аммиака, глутамина, глутаминовой кислоты, о дина­мике азота амидных групп белков в мозге при гипотермии и по­ следующем согревании [1, 2, 4, 7, 9, 11, 27, 34, 36, 46, 58, 60].

Следует заметить, что в первых исследованиях по изучению азотистого метаболизма в мозге животных [39] при гипотермии использовались разные методики определения аммиака и других азотсодержащих наркотических веществ и фармакологических препаратов. Следовательно, на результатах экспериментов сказались ошибки этих методик.

Я. И. Векслер [1] установил, что гипотермия (20 °С) под наркозом, вызванная в холодовых одеялах, приводит к значительному­ нарастанию концентрации аммиака в мозге крыс, по сравнению с контрольными наркотизированными (в среднем 2,74 мг % против 0, 49 мг % по его азоту). Найдено, что содержание глутамина при этом снижается с 6,00 мг % до 5,10 мг % (по амид­ному азоту),

а содержание глутаминовой кислоты остается без изменения.

В работах М. С. Гаевской и Е. А. Носовой [8, 9] показано, что в условиях гипотермии по время клинической смерти в коре мозга собак содержание аммиака значительно возрастает, особенно при температуре тела 26–23 °С. При этом параллельно снижается содержание глутамина; в состоянии­ глубокой гипотермии (20–10 °С) количество аммиака возрастает­ в первые 30 минут вдвое, а затем почти не изменяется в течение полутора часов клинической смерти.

Содержание глутамина при гипотермии 20–10 °С оставалось неизменным

иравным исходному (5,4 мкмоль/г) в течение 2 часов клинической смерти, а в условиях нормотермии (37–36 °С) концентрация­ глутамина в коре мозга к 5-й минуте клинической смерти снижалась с исходных величин в среднем до 3,7 мкмоль/г. Исследование содержания свободных аминокислот в коре мозга собак, умиравших в состоянии глубокой гипотермии, показало,­ что количество глутаминовой кислоты не изменяется, увеличивается концентрация аланина

иметионина, а уровень содержания γ-аминомасляной кислоты на много снижается по сравнению с умиравшими при нормотермии животными [8].

Усобак, подвергнутых глубокой гипотермии (15–10 °С) в пищеводе методом искусственного кровообращения, содержание глутаминовой и аспарагиновой кислот в ткани мозга повышалось соответственно на 19 и 38 % по сравнению с контрольными животными­.

Известный интерес представляют опыты Л. И. Кузнецова, Е. В. Лахно и др. [26], показавших, что даже при местном охлаждении конечности животного в коре полушарий головного мозга противоположной стороны снижается активность дегидрогеназ­ глутаминовой и молочной кислот.

В гомогенатах мозга и других органов крыс, охлажденных до 24–20 °С, наблюдались различные изменения глутаминощавелевоуксусной и глутаминопировиноградной аминотрансфераз. А также падение активности таких ключевых ферментов, как γ-аминомасляная кислота α-кетоглутаратаминотрансферазы. Многие исследователи изучили азотистый обмен мозга при гипотермии при сочетании общего охлаждения с другими воздействиями­ на организм подопытного животного (гипоксия, выключение­ сердца, смертельное кровопускание

идр.).

Торн и Хейман [93] вызывали у наркотизированных­ кроликов ишемию мозга путем наложения шейной манжеты и аноксии (вдыхание азота). По мере развития кисло­родного голодания происходило линейное повышение содержа­ ния аммиака в мозговой ткани. Авторы наблюдали, что при охлаждении животных до 26 °С нарастание аммиака в мозге происходит­ с меньшей скоростью и в меньшей степени (в среднем 0,0243 ммоль/л в мин), чем при нормальной температуре тела (0,0337 ммоль/л в мин).

В тканях мозга кошек при временном выключении сердца в условиях гипо-

термии 25–24 °С происходит нарастание концентрации­ аммиака с 0,32 мг % (при

нормотермии) до 1,00 мг % [9]. Одновременно происходит и нарастание количества глутамина с 6,5 до 9,50 мг %. Выход животного из состояния гипотермии и восстановление кровообращения, особенно­ на начальных этапах согревания, характеризовались новым подъемом содержания аммиака в мозге и снижением количества свободного глутамина. Автор объясняет это усилением кислород­ ной недостаточности. Через 3 часа после восстановления кровообращения­ вновь увеличивается содержание аммиака в мозговой ткани с одновременным уменьшением уровня глутамина. Снижение­ концентрации лабильных фосфатов и повышенно молочной кислоты в параллельных опытах автора указывали на торможение­ тканевого дыхания в ткани мозга. Нормализация показателей­ азотистого обмена наблюдается лишь через 24–72 часа.

И. Р. Петрову и Е. В. Гублеру [39] удалось полное восстановление соотношений в аммиак-глутаминовой системе после 20-минутной гипоксии в условиях гипотермии при применении комплексной терапии (в дыхании 50 % кислорода, введение глюкозы, витамина С, адреналина, активное согревание и др.).

В работах М. С. Гаевской и Е. А. Носовой [9] было исследовано изменение содержания аммиака и глутамина в коре мозга собак, умиравших от кровопотери при глубокой и средней гипотермии. Авторы приходят к выводу, что гипотермия не замедляет образование аммиака в мозговой ткани при умирании, но оказывает тормозящее влияние в отношении распада глутамина. В опытах на­блюдалась вторая волна нарастания аммиака в мозге: через 24 часа после оживления в условиях гипотермии и через 4 часа – в условиях нормотермии вновь накапливается значительное количество­ аммиака (1,3 мкмоль/г).

Энергетический обмен и содержание­ глутамина при этом не отличались от нормы. При данной постановке опытов авторы не нашли признаков гипоксии в ткани мозга и делают заключение, что повышенное количество аммиака­ в мозге при гипотермии обусловливается не гипоксией, а другими­ причинами.

Как видно, приведенные литературные материалы по азотистому обмену мозга при гипотермии и последующем согревании разрознены и противоречивы. Различная методика охлаждения животного, сочетание­ гипотермии с воздействием других чрезвычайно активных­ факторов, резко изменяющих реакцию организма на охлаждение,­ постановка опытов на крупных животных – все это гово­рит о том, что мы не располагаем достаточным фактическим материалом о состоянии процессов азотистого метаболизма при гипотермии.

Более углубленным исследованием некоторых сторон азотистого обмена головного мозга при гипотермии и последующем согревании занялись­ Я. И. Векслер и З. С. Гершенович [1]. Эксперименты­ проведены на белых крысах. Охлаждение проводилось без сочетания с каким-либо дополнительным

воздействием и без применения фармакологических средств. Гипотермию

содержание аммиака увеличивается на 190 и 74 % по отношению к предыдущему этапу, то во втором периоде гипотермии этот прирост отчетливо нарастает до 205 % (для 30–25 °С) и 367 % (для 25–20 °С).

Авторы подтвердили результаты своих исследований опытами­ in vitro. Отмытые срезы мозга охлажденных крыс даже в оптимальных условиях инкубации продолжают сохранять способность­ к высокому аммиакообразованию, возникшую в связи с гипотермией. Способность к накоплению аммиака прогрессивно нарастает по мере снижения температуры тела и на конечных этапах гипотермии (20–19 °С) превышая количества высвобожденного­ срезами контрольных животных на 44 %. Следовательно, Я. И. Векслер и З. С. Гершенович [1] установили, что интенсивное накопление аммиака в мозге при охлаждении организма является­ результатом изменения местного метаболизма нервной ткани.

О глубине и стойкости изменений в системе освобождения и устранения аммиака в мозге при охлаждении свидетельствуют исследования авторов, проведенные на различных этапах выведения­ животных из гипотермического состояния (табл. 1).

При согревании животного количества аммиака и глутаминовой­ кислоты уменьшается, а содержание глутамина возрастает­. Однако нормализация нарушенных взаимоотношений наступает­ не сразу. В ходе согревания содержание аммиака в мозге более высоко, чем при той же температуре тела при охлаждении животного.

Эти данные находят подтверждение также и в опытах Я. И. Векслера [1].

Если накопление аммиака в срезах мозга контрольных животных составляет за 1 час 11±0,68 мг %, то при самостоятельном согревании до 30 и 37 °С после глубокой гипотермии концентрация аммиака в срезах мозговой ткани, со­ ответственно, составляет 15,2±1,36 и 14,9±0,68 мг %.

Приведенные материалы дали право авторам заключить, что нарушение

ваммиакобразующих системах мозга и накопление свободного аммиака при гипотермии являются следствием процессов,­ разыгрывающихся в организме

всвязи с его охлаждением­ и по мере развития охлаждения, и представляют собой характерную черту метаболизма мозга при пониженной температуре­ тела.

Многие исследователи в последнее время начали изучать изменения белков при гипотермии и последующем согревании.

Большое количество аммиака в мозге при гипотермии могло возникнуть из амидных групп белков. Исследования показали [7], что амидные группы бел­ков мозга подвергаются изменениям при искусственном охлаждении­. Уже на первых этапах гипотермии (35 °С) наблюдаются изменения­ в соотношении лабильного и прочно связанного амидного­ азота суммарных и водорастворимых белков

мозга. По мере снижения температуры тела до 20 °С происходит равномерное

уменьшение количества амидного азота обоих фракций белков головного мозга. Так, при ректальной температуре 20–19 °С содержание­ амидного азота водорас-

творимой фракции падает с 4,1±0,134 мкг/мг до 2,1±0,186 мкг/мг сухого белка, т.е. почти на 50 %, а суммарных белков – 6,7±0,083 мкг/мг до 4,1±0,210 мкг/мг, т.е. на 47 %. При дальнейшем снижении температуры тела (15–13 °С) крыс автором найдено возрастание амидированности­ белков обеих фракций по сравнению с предыдущим этапом­ гипотермии.

Самосогревание после охлаждения изменяет амидированность­ белков по сравнению с гипотермическими животными. Количество лабильного амидного азота продолжает уменьшаться­ (с 2,6 до 1,9 мкг/мг белка), а прочносвязанного – увеличиваться­ (с 2,5 до 3,3 мкг/мг).

При снижении температуры тела отношение лабильного к прочносвязанному амидному азоту в суммарных белках мозга увеличивается от 0,5 до 0,9. В водорастворимых белках на­блюдается обратное явление. Это, по-видимому, свидетельствует о том, что белки при гипотермии могут быть и донаторами

иакцепторами аммиака.

М.С. Гаевская [9] предполагала, что в нервной клетке при гипотермии

ипри выведении из состояния клинической смерти в белках мозга происходят трансконформационные изменения. Одним из главных источников аммиака в мозге при охлаждении организма по результатам исследований автора являются амидные группы белков.

Экспериментальные данные о нарушении азотистого метаболизма­ мозга при гипотермии со значительным накоплением ам­миака послужили основани-

ем для испытания в качестве защит­ных средств при искусственном охлаждении животного глутаминовой­ кислотой, аргинином и мочевиной. Как известно, эти соединения, введенные парентерально, активно вмешиваются в метаболизм аммиака в центральной нервной системе, нормализуя­ нарушенные функции головного мозга [10, 12].

Исследования показали, что подкожное введение нейтрализованного­ раствора глутаминовой кислоты на физиологическом растворе­ приводит к значительному снижению содержания аммиака в мозге крыс на этапах охлаждения

ипоследующего согревания по сравнению с контрольными гипотермическими

исогревшимися после гипотермии животными [1, 11]. При этом концентрация глутамина существенно не изменяется, а уровень содержания глутаминовой кислоты несколько снижается. Однако смертность подопытных животных в течение месяца после охлаждения почти не изменяется,­ составляя 36 % против 32 % – в контроле.

Авторы установили, что в случае введения аргинина внутрибрюшинно при охлаждении содержание аммиака в мозге крыс составляет в среднем

2,17±0,54 мг % (при 20 °С), а при сог­ревании до 37 °С – 2,8±0,21 мг % (в контроле,

соответственно, 5,43 и 3,03 мг %). У подопытных охлажденных животных увеличивается­ содержание глутамина и несколько снижается содержание

глутаминовой кислоты. При этом резко увеличивается выживаемость­ крыс после охлаждения. При снижении температуры тела до 20–19 °С у животных с введенным аргинином в течение месяца выживаемость составляет 100 %, при охлаждении до 18–17 °С – 95 % (в контроле 52 %), а при охлаждении даже до 15–14 °С – 49 % (в контроле 21 %). Инъекция же мочевины увеличивает выживаемость крыс, подвергнутых глубокой гипотермии, на 50–55 % [7, 11, 12].

Введение мочевины сказывается на изменении реакции белков мозга при действии низкой температуры на организм [7]. Предварительное введение мочевины тормозит­ дезамидирование суммарных белков головного мозга крыс при гипотермии, количество амидных групп увеличивается от 5,1±0,31 до 6,0±0,091 мкг/мг белка [7]. В водорастворимых белках мозга крыс при этом дезамидирование тормозится слабо, но происходит активная перегруппировка лабильных и прочносвязанных­ амидных групп и соотношение их уменьшается более чем на 50 %.

Найдено, что охлаждение животного приводит к некоторому­ снижению содержания мочевины в мозговой ткани [1].

Вышецитированный материал дает право заключить, что освобождение аммиака в мозге при гипотермии является обязательной­ реакцией нервной ткани. В обменных процессах, сопровождающих­ гипотермию, активно участвуют амидные группы белков мозга и другие низкомолекулярные азотистые метаболиты,­ такие как глутамин, глутаминовая и γ-аминомасляная кислоты,

аргинин, мочевина и др. Но их роль в устранении и освобождении аммиака остается неясной.

Задача дальнейших исследований заключается в повышении устойчивости теплокровного животного к глубокому охлаждению и стимулировании механизмов адаптации к гипотермии и воздействию холода и на организм. Это должно значительно расши­рить возможности практического применения гипотермии и способствовать успешной борьбе с вредными последствиями воздействия низкой температуры окружающей среды.

Глава 2.

Влияние гипотермии на энергетический, белковый и липидный метаболизм в мозге

В соответствии с совершенствованием методов изучения физикохимических основ, физиологических состояний центральной нервной системы

исовершенствованием методов вызывания гипотермических состояний в эксперименте нами анализируется как литературные материалы, так и данные собственных экспериментов, полученных в нашей лаборатории, по влиянию гипотермии на энергетический белковый и липидный обмен в мозге теплокровного организма.

Одним из внешних факторов, существенно влияющих на течение физиологических и биохимических процессов в организме, является тем­пература. На суше это и наиболее изменчивый фактор внешней среды. Поэтому формирование в ходе эволюции у живых организмов терморе­гуляции, важнейшим толчком в развитии которой послужил выход их на сушу, имело большое биологическое значение.

Гомойотермия способствовала интенсификации обмена веществ и сопровождалась прогрессивным развитием кровеносной, гормональной и нервной систем.

Центр терморегуляции, находящийся в гипоталамусе, координирует пери­ ферические­ рефлексы и активирует гормональную стимуляцию метаболизма­ до того, как понизится температура тела. В терморегуляции участвуют также гиппокамп, ядро амигдалы, мозжечок, шейный отдел спинного мозга. Термо­ регуляторная роль коры головного мозга проявляется­ в осуществлении сложнорефлекторных актов [30, 48].

Гипотермия оказалась­ весьма ценным помощником при оперативных вмешательствах, лечении­ ряда болезней [17, 34, 39, 41, 42]. Основным защитным механизмом гипотермии является снижение энергетических расходов, а следовательно, увеличение резистентности мозга к ишемии. Однако гипотермия теплокровного организма дает очень много летальных­ исходов, вызывает глубокие нарушения функций, дискоординацию обменных процессов в тканях организма [1, 8, 39, 58, 62].

Центральная нервная система особенно чувствительна к гипотермии [93]

ифункционирует в более узком диапазоне температур, чем другие ткани.