Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 101

повышение активности фермента в печени крыс на этапах­ пролонгированной гипотермии может быть обусловлено индукцией фермента кортикостероидными гормонами. Данные литературы свидетельствуют­ о значительно меньшей чувствительности к интенсивному охлаждению системы гипофиз – кора надпочечников у различных видов­ животных, впадающих в зимнюю спячку, по сравнению с животными,­ не имеющими такой адаптации [9].

На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что относительно высокая активность аргиназы, стабильное содержание­ мочевины в исследуемых органах зимоспящих животных при разных температурах тела, по-видимому, обеспечивают сохранение нативной информации клеточных белков, липидов и их комплексов. Результаты, полученные в модельных опытах с животными, по-разному адаптирующимися к гипотермии, подтверждают участие компонентов­ цикла мочевины в развитии компенсаторно-адаптивных перестроек в метаболизме организма при действии холода.

Литература

1.Грищенко В. И. Достижения н перспективы развития криобиологии и криомедицины // Тез. докл. Международной конф. Харьков, 1988. С. 4–5.

2.Калабухов И. И. Спячка млекопитающих. М.: Наука, 1985. 258 с.

3.Эмирбеков Э. З., Львова С. П. Механизмы биохимических изменении при низких температурах тела. Изд-во: Ростов н/Д., 1985. 80 с.

4.Кричевская Л. А., Лукаш А. И., Шугалей В. С., Бондаренко Т. И. Амино­ кислоты, их производные в регуляции метаболизма. Ростов н/Д: Изд-во

Ростовского ун-та, 1983. 110 с.

5.Шугалей В. С., Козина А. С. Содержание мочевины и активность аргиназы в органах крыс при акклиматизации к холоду // Физиол. журн. СССР. 1977. № 8. С. 1199–1202.

6.Kолб В. Г., Камышникова В. С. Определение мочевины в сыворотке крови и в моче по цветной реакции с диацетилмонооксимом // Клиническая биохимия. Минск: Беларусь, 1976. 311 с.

7.Лукаш Л. П. Роль взаимодействия мочевины с белками мозга и механизмах ее защитного эффекта при гипероксии: Автореф. дис. … д-ра биол. наук. Ростов н/Д, 1979.

8.Давтян М. Л., Бунятян Г. Х. Очистка и свойства аргиназы головного мозга крыс // Биохимия. 1970. № 2. С. 411–418.

9.Корякина Л. Реакция гипотоламо-гипофизарнонадпочечниковой системы на холодовой стресс у животных с зависимой и регулируемой формой адаптации // Механизмы­ зимней спячки. Пущино, 1987. С. 196–202.

3.19. АТФазная и ацетилхолинэстеразная активность мозга при гипотермии

Гипотермия нашла применение в медицинской практике как метод минимилизации функций и метаболизма органов и тканей организма.

Более широкому использованию метода общего охлаждения препятствовал ряд факторов, среди которых центральное место занимают нарушение мембранных структурах и дискоординация ферментативных процессов.

Для выяснения влияния низкой температуры на теплокровный организм важное значение имеет изучение активности мембранных ферментов мозга, участвующих в обеспечении синаптической функции.

В настоящей работе изучена активность Na+, К+-АТФазы и ацетилхолинтесразы (АХЭ) в различных структурах мозга при гипотермии различной продолжительности.

Опыты проведены на 50 лабораторных белых крысах-самцах массой 150–200 г. Животных охлаждали в течение 1 ч до ректальной температуры 20 °С. В другой серии опытов достигнутую гипотермию пролонгировали в течение 2 ч. Контролем служили интактные крысы. В нужный момент как контрольных, так и подопытных животных декапитировали, быстро извлекали большие полушарии мозга

исредний мозг вместе с промежуточным. Ткани мозга гомогенизировали в среде, содержащей 1,25 М сахарозу, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4 при 2 °С. Полученные 10 % гомогенаты центрифугировали­ 10 мин при 600 g. Надосадочную жидкость использовали для определения активности Na+, К+-АТФазы, которую рассчитывали как

разность­ между общей и Mg2+-АТФазой. Среда для определения общей АТФазы

содержала (в миллимолях); NaCl – 130, КСl – 20, АТФ – 3, MgCl2 – 3, трис – 30, рН 7,4 при 37 и 20 °С; при определении Mg2+-АТФазы активность К+, Na+-АТФазы подавляли добавлением 10–4 М строфантина К. Реакцию начинали добавлением 0,2 мл разведенного гомогената (150–200 мкг белка). Пробы инкубировали 15 мин при 37 °С при температуре тела охлажденного­ животного (20 °С). Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 20 % ТХУ. Об активности фермента судили по приросту в среде инкубации­ Рi. Активность Na+, К+-АТФазы выражали­ в микромолях Pi на 1 мг белка за 1 ч. Белок определяли по методу Лоури.

Устанавливали­ ацетилхолинэстеразную активность модифицированным методом с использованием в качестве субстрата­ ацетилтиохолин йодида (АТХ). Для исследования брали большие полушария мозга, средний и промежуточный мозг, мост вместе с продолговатым мозгом. 10 % гомогенаты, при­готовленные на холодном 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 8,0, после разведения исполь­ зовали в качестве источника фермента. Пробы инкубировали 20 мин при 37

и20 °С. Активность­ АХЭ выражали в микромолях АТХ на 1 г влажной ткани за

1 ч. Полученные данные обрабатывали статистически.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 103

Таблица 31 Na+, К+-АТФазная активность (в микромолях на 1 мг белка в 1 ч)

мозга крыс при гипотермии (M±m; n=6)

Примечание. Здесь и в табл. 32 звездочкой – обозначены достоверные различия по отношению к контролю при соответствующей температуре инкубации.

При снижении температуры инкубации­ гомогенатов больших полушарий,

атакже среднего и промежуточного мозга с 37 до 20 °С активность Na+, К+- АТФазы в гомогенатах мозга интактных­ крыс уменьшается соответст­венно в 2,6 и 2,7 раза, а у животных, охлажденных до 20 °С, – в 3,5 и 3 раза­.

Охлаждение животных до 20 °С не влияет на активность Na+, К+-АТФазы печени, измеряемой при 20 °С. В случае пролонгирования гипотермии до 2 ч активность этого фермента в среднем и промежуточном мозге снижается­ в 2 раза.

При инкубации гомогенатов при температуре 37 °С охлаждение животных до 20 °С достоверно повышает активность Na+, К+-АТФазы в указанных отделах мозга; увеличение продолжительности гипотермии до 2 ч нивелирует этот

эффект (см. табл. 31). Учитывая, что в поддержании нативной конформации молекулы Na+, К+-АТФазы (а значит, и ее активности) важную роль играют фосфолипиды, можно думать, что обнаруженные при гипотермии изменения активности фермента объясняются фазовыми переходами липидов.

Как видно из табл. 32, активность ацетилхолинэстеразы в гомогенатах больших полушарий мозга, среднего и промежуточного мозга, а также моста продолговатого мозга снижается при уменьшении температуры инкубации 37 до 20 °С у интактных крыс, соответственно, в 1,7, 1,6 и 1,8 раза, а у животных, охлажденных до 20 °С, – 1,4, 1,4 и 1,6 раза.

Гипотермия как кратковременная, так и длительная приводит к достоверному повышению активности ацетилхолинэстеразы во всех исследованных

отделах мозга на 20–25 % независимо от температуры инкубации гомогената (см. табл. 32). Полученные результаты показывают, что гипотермия оказывает различное влияние на активность Na+, К+-АТФазы и ацетилхолинэстеразы мозга крыс: при температуре инкубации, соответствующей­ температуре тела охлажденного­ животного (20 °С), активность­ Na+, К+-АТФазы не изменяется,

аацетилхолинэстеразы – повышается по сравнению с таковой у контроль­

ных (нормотермических) животных. Разные изменения активности Na+, К+- АТФазы и ацетилхолинэстеразы в мозге при гипотермии, видимо, объясняются­ различным характером их встроенности в мембранные структуры­.

Таблица 32 Ацетилхолинэстеразная активность (в микромолях ацетилтиохолина на 1 г

ткани в 1 ч) мозга крыс при гипотермии 20 °С (M±m; n=6)

3.20. АКТИВНОСТЬ И ТЕМПЕРАТУрНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ КИСЛОЙ ПЕПТИДГИДРОЛАЗЫ В ТКАНИ МОЗГА АДРЕНАЛЭКТОМИРОВАННЫХ КРЫС ПРИ УМЕРЕННОЙ ГИПОТЕРМИИ

Определяли активность кислой пептидгидролазы (КФ 3.4) и ее температур­ ную зависимость в коре больших полушарий и суммарно в среднем и промежуточном мозге крыс в норме, после ложной операции и при двусторонней

адреналэктомии, а также­ при умеренной (30 °С) гипотермии интактных, ложнооперированных и адреналэктомированных­ животных.

Установлено, что более активность фермента изменяется в коре боль­ших полушарий. Адреналэктомия вызывает ее снижение в коре при температуре инкубации­ 30 и 20 °С. Инкубация при температуре 37, 25, 20 и 15 °С вызывает снижение активности и при охлаждении животных. Совместное воздействие гипотермии и адреналэктомии на активность фермента неаддитивно.

Принудительное охлаждение теплокровных приводит к значительному­ нарушению обмена в мозге. Возникают изменения и в катаболизме­ клеточных белков мозга.

Ранее нами было показано значительное увеличение активности­ кислой пептидгидролазы в условиях глубокой гипотермии (20 °С), однако при умеренной гипотермии (30 °С) достоверных изменений не наблюдалось.

Биохимические изменения в мозге при неглубокой (30 °С) гипотермии­ в определенной степени представляют собой результат стрессорной реакции. Существенную роль в ней играет гипофизарноадреналовая система и ее звено –

кора надпочечников.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 105

Поэтому представляло интерес сравнить влияние умеренной гипотермии­ на активность и температурную зависимость кислой пептидгидролазы­ в мозге интактных и адреналэктомированных крыс. Предполагалось­ также, что изучение температурной зависимости активности фермента позволит выявить ее изменения и при умеренной гипотермии­.

Исследования проведены на лабораторных белых крысах-самцах трехмесячного­ возраста массой 180–200 г.

Гипотермию вызывали в специальной камере, через «рубашку» которой циркулировала­ холодная (4–5 °С) вода. Животных охлаждали равномерно

имедленно так, что ректальную температуру снижали до 30 °С за 20–25 мин. Гипотермию вызывали и у адреналэктомированных крыс. Надпочечные железы удаляли трансабдоминально под эфирным наркозом. В качестве контроля использовали интактных и ложнооперированных крыс.

Как подопытных, так и контрольных животных декапитировали, быстро извлекали головной мозг. Активность кислой пептидгидролазы определяли, используя гемоглобин­ как субстрат, при рН 3,8 в гомогенатах коры больших полушарий и суммарно в среднем и промежуточном мозге, и выражали в микрограммах тирозина, отщепившегося от гемоглобина за 60 мин, в расчете на 1 мг белка.

Температурную зависимость активности фермента определяли при температуре инкубации 37, 30, 25, 20 и 15 °С.

Содержание белка в пробах определяли по Лоури и соавт.

Полученные результаты обрабатывали статистически с применением критерия Стьюдента.

Как следует из таблицы 33, активность кислой пептидгидролазы в гомогенатах тканей коры больших полушарий интактных крыс, определенная­ при температуре инкубации 30, 25, 20 и 15 °С, составляет соответственно 71, 61, 57

и38 % ее уровня при 37 °С. В общем гомоге­нате среднего и промежуточного мозга эти значения соответствуют 77, 66, 57 и 40 %.

Ложная операция не влияет на активность фермента в среднем и промежуточном мозге и коре больших полушарий. При двустороннем удалении надпочечников она достоверно­ снижается в коре больших полушарий при температуре инкубации 30 и 20 °С (на 28 и 34 % соответственно по сравнению с активностью у ложнооперированных животных).

Уинтактных крыс, охлажденных до 30 °С, ферментативная активность­ в коре при температуре 37, 25, 20 и 15 °С снижается соответственно­ на 17, 18, 36 и 21 %.

В условиях гипотермии 30 °С в коре больших полушарий ложно­ оперированных животных при разных температурах инкубации актив­ность фермента изменяется. При 30, 20 и 15 °С она снижается па 21, 34 и 45 % соответственно (р<0,05) по сравнению с активностью у неохлажденных­ ложнооперированных животных.

Активность кислой пептидгидролазы (рН 3,8) при умеренной гипотермии

(30 °С) (в мкг тирозина на 1 мг белка за 60 мин инкубации; М±m; n=6–8)

Примечание. Звездочкой отмечены достоверные различия (р<0,05).

Температурная зависимость активности фермента в коре больших полушарий адреналэктомированных и ложнооперированных крыс существенно различается,­ что, очевидно, связано со структурными изменениями фермента на уровне лизосомных мембран. В среднем и промежуточном мозге эти изменения выражены слабее и это, видимо, связано с функциональным­ различием исследуемых отделов. При снижении температуры тела адреналэктомированных крыс в коре больших полушарий и среднем­ – промежуточном мозге изменений ферментативной активности не выявлено по сравнению с активностью ее у нормотермических адреналэктомированных животных.

Полученные данные согласуются с представлениями о том, что наиболее чувствителен к экстремальным факторам филогенетически более молодой и функционально более сложный отдел головного мозга – кора больших полушарий.

Мы установили снижение активности кислой пептидгидролазы как при умеренной гипотермии (30 °С) при температуре 37, 25, 20 и 15 °С, так и при адреналэктомии в норме при температуре 30 и 20 °С больших полушарий. Можно ли

говорить об одинаковой природе этих изменений, судить еще трудно.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 107

Одним из механизмов, лежащих в основе наблюдаемых изменений активности кислой пептидгидролазы, является влияние кортикостероидов на стабильность

мембран лизосом. Предполагают два возможных­ пути воздействия гормонов коры надпочечников на структуру мембран: непосредственное влияние молекул стероидных гормонов н опосредованное – через биохимические процессы.

Возможные причины изменения активности кислой пептидгидролазы,­ обнаруженные нами, предстоит выяснить. Одной из таких причин­ может быть изменение содержания этих гормонов в мозге при гипотермии.

3.21. ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ НА СУБКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ

И НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КАТЕПСИНА D В ГОЛОВНОМ МОЗГУ КРЫС

Общее охлаждение крыс до ректальной температуры 30 и 20 °С достоверно не изменяет соотношение относительной удельной активности катепсина D в субклеточных фракциях головного мозга крыс.

При гель-хромотографическом анализе гетерогенности молекулярных форм катепсина D субклеточных фракций установлено наличие высокомолекулярной (во фракциях митохондрий лизисом и микросом) и низкомолекулярной (в фракциях митохондрий лизосом и цитозола) форм фермента.

При гипотермии (20 °С) в цитозольной фракции мозга крыс появляется ми­

норный пик активности катепсина D, соответствующий высокомолекулярной форме фермента.

Известно, что глубокая гипотермия (20 °С) вызывает увеличение активности катепсина D (кислой пептидгидролазы, КФ 3. 4. 23) в неседиментируемой фракции головного мозга крыс при гомогенизации в гипотонической среде. Катепсин не солюбилизируется при гомогенизации­ в 0,25 М растворе сахарозы. Относительно слабо высвобождается­ катепсин D из ткани мозга и при действии других экстремаль­ных факторов. Учитывая то, что влияние экстремального воздействия­ (ионизирующее излучение) приводит к изменению физико-химических­ свойств лизосомного катепсина D, мы изучали влияние гипотермии на субклеточное распределение и некоторые физико-химические­ свойства катепсина D мозга крыс.

Опыты проводили на крысах линии Вистар массой 160–180 г. Гомогенаты тканей готовили на 0,32 М растворе сахарозы в трис-НСl-буфере, рН 7,2. После осаждения­ ядер (1300 g; 10 мин), надосадочную фракцию центрифугировали (12000 g; 20 мкг). Полученный осадок характеризовали как митохондральноли-

зосомную фракцию­. Фракцию микросом получали из надосадочной жидкости

путем центрифугирования­. Конечная надосадочная жидкость представляла собой цитозольную фракцию. Фракции ядер, митохондрий лизосом и микросом ресуспендировали в 0,32 М растворе сахарозы, приготовленном из трис- НСl-буфере, рН 7,2, и отбирали пробы для определений активности катепсина D и содержания белка.

Инкубационная смесь для определения активности катепсина D состояла из 0,5 мл 1,25 %-ного раствора, гемоглобина в 0,05 М раствора ацетатного буфера, рН 3,2 и 0,2 мл ферментного препарата. Содержание растворимых

втрихлоруксусной кислоте продуктов гидролиза гемоглобина определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Перед проведением гель-хромотографического анализа для солюбилизации мембраносвязанного фермента 2 мл исследуемых фракций и гомогената инкубировали 30 мин в присутствии 0,2 %-ного тритона Х-100. Фермент при этом переходил в надосадочную­ жидкость. Осадки отделяли центрифугированием (15000 g; 30 мин). На колонку наносили по 1 мл исследуемых препаратов: цитозольной фракции и тритоновых экстрактом гомогената, фракций митохондрий-лизосом и микросом.

Гель-хромотографический анализ проб проводили на колонке с сефадексом G-150, уравновешенной пропусканием пяти объемов трис-HCl-буфера с 0,5 М NaCl и 0,2 %-ным тритоном Х-100, рН 7,2. Белок элюировали тем же буфером со скоростью 6 мл в 1 ч. Объем проб элюата при фракционировании составлял 0,8 мл. Ферментативную активность в элюатах выражали в мкг тирозина, отщепленного от гемоглобина в течение 60 мин инкубации при 37 °С и рН 3,2 в рас-

чете на 1 мг белка фракции. Содержание белка в субклеточных фракциях мозга определяли по Лоури и соавт. Молекулярную массу фермента вычисляли по результатам гель-хроматографии,­ используя для калибровки колонки голубой дексгран и белки-стандарты: гемоглобин быка и сревый ингибитор трипсина фирмы “Reanal” (Венгрия), цитохром с фирмы “Serva” (ФРГ).

Распределение активности катепсина D в субклеточных фракциях мозга

внорме и при гипотермии приведено на рис. 3, из которого следует, что катепсин D содержится во всех исследованных фракциях.

Наибольшее его количество – во фракции митохондрий лизосом. Рас­ творимая же фракция (цитозоль) содержит лишь седьмую часть активности­ фермента в этой фракции.

Охлаждение крыс до ректальной температуры 30 и 20 °С достоверно­ не изменяет соотношений относительной удельной активности катепсина D

всубклеточных фракциях мозга крыс. Таким образом, как умеренная, так и глубокая гипотермия, по-видимому, не приводят к патологическим последствиям, связанным с разрушением лизосом и высвобождением катепсинов

впротоплазму.