Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 91

Эксперименты проводили на малых сусликах (Citellus pygmaeus Pall.), отловленных­ в апреле–мае 1969 г. в Дагестане. Животных охлаждали с помо-

щью холодовых одеял, в которых циркулировала вода температурой 3–5 °С. Температуру тела снижали в течение 30, 45–55 и 65–70 мин соответственно до 30, 20–19 и 10 °С. Контролем служили­ нормотермические животные. По истечении срока охлаждения подопытным и контрольным­ животным быстро отсекали голову, вскрывали мозг, отделяли большие полушария,­ мозжечок, средний и промежуточный мозг.

Дли определения активности глутаминазы-1 гомогенат готовили на холоде (при температуре 2–4 °С) в смеси Мак-Ильвейна с глюкозой при рН 7,3 с 0,15 М фосфатным буфером рН 8,0. Опытные пробы состояли из 100 мг ткани соответствующего отдела мозга и 5 мкМ глутамина. В контрольные пробы глутамин не добавляли. Все пробы ин­кубировали в течение 1 ч при температуре 37 °С и при более низкой температуре, соответствующей­ уровню гипотермии. Промежуток времени с момента обезглавливания животного до начала инкубации гомогената составлял 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 1 мл охлажденной 10 %-ной трихлоруксусной кислоты. В безбелковом фильтрате определяли содержание аммиака. Активность глутаминазы-1 выражали в микромолях азота аммиака, отщепленного от амидной группы­ глутамина, на 1 г влажной ткани за 1 ч.

У нормотермических сусликов активность глутаминазы-1 и больших полушариях мозга составляет 24,9±0,44, в мозжечке – 31,77±0,65, в среднем и промежуточном мозге – 28,41±0,25 мкМ азота аммиака на 1 г свежей ткани за 1 ч (табл. 25).

При снижении температуры тела зверьков до 30 °С активность глутамина­зы­-1 в больших полушариях мозга уменьшается незначительно – на 6,1 %, в мозжечке – на 23,2 %, а в среднем и промежуточном мозге – на 27,7 %. При температуре тела 20–19 °С активность глутаминазы снижается­ в больших полушариях мозга на 69,5 %, в мозжечке – на 84,9 %, в среднем и промежуточном мозге – на 77,4 %.

Дальнейшее понижение температуры тела сусликов до 10 °С сопровождается

уменьшением активности глутаминазы-1 в больших полушариях мозга и в мозжечке. В среднем и промежуточном мозге активность фермента сохраняется на

том же уровне, что и у зверьков, охлажденных до температуры 20 °С.

Ранее нами было показано, что при гипотермии в мозге сусликов содержание глутамина увеличивается. Это соответствует снижению активности­ глутаминазы. Видимо, у животных, впадающих в зимнюю спячку, в отличие от других при гипотермии глутамин не может быть источником­ освобождения аммиака в тканях мозга.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в разных отделах головного мозга глутаминаза в разной степени чувствительна к понижению­ температуры тела.

3.17. ГЛУТАМИНАЗНАЯ И ГЛУТАМАТДЕКАРБОКСИЛАЗНАЯ АКТИВНОСТИ ТКАНИ МОЗГА ПРИ ГИПОТЕРМИИ И ЗИМНЕЙ СПЯЧКЕ

При принудительном охлаждении крыс и сусликов активируемая фосфатом глутаминазная активность мозга снижается по мере уменьшения температуры инкубации­. Охлаждение крыс приводит к снижению глутаматдекарбоксилазной активности мозга. Однако у охлажденных до 20 °С животных температура инкубации (25 и 10 °С) не влияет на нее.

Начало зимней спячки сопровождается повышением глутаматдекарбокси-

лазной активности мозга, а через месяц она снижается по сравнению с началом спячки. Глутаминазная­ активность при зимней спячке снижается. В начале зимней спячки активирующее­ влияние фосфата на глутаминазу мозга ослабляется, через неделю – усиливается,­ а к месячному сроку снова ослабляется.

Охлаждение теплокровного организма, как и естественное понижение­ температуры тела (зимняя спячка), вызывают сходные изменения в азотистом обмене в мозге, выражающиеся в увеличении содержания­ аммиака. В то же время источники высвобождения и связывания­ аммиака в тканях мозга при гипотермии и зимней спячке различаются.

Известно, что активным источником высвобождения аммиака в мозге как при принудительном охлаждении, так и во время зимней спячки является глутамин. Содержание аммиака влияет на активность глутаминазы­. В мозге обнаружено три ее изоформы, активируемые фосфатом,­ карбонатом или малеонатом и фосфат-боратом; это свидетельствует­ о сложности процесса регуляции дезамидирования глутамина­.

Продукт дезамидирования глутамина – глутамат в мозге активно­ декарбок-

силируется с образованием специфического компонента гамма-аминомасляной

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 93

кислоты, содержание которого в тканях мозга снижается при охлаждении теплокровного организма. Для выяснения функциональной роли аммиак-

глутаминовой системы мозга при пониженной жизнедеятельности значительный интерес представляет­ исследование глутаминазной и глутаматдекарбоксилазной активности­ тканей мозга зимоспящего и незимоспящего животных при различных­ температурах принудительного и естественного охлаждения.

Эксперименты проведены на белых лабораторных крысах и малых сусликах (Citellus pygmaeus Pall.). Суслики отловлены на Кизлярских пастбищах Дагестана в мае 1976 г.

Гипотермию вызывали, помещая животных в холодовые одеяла, в которых циркулировала­ вода с температурой 3–5 °С. Исследования проведены при ректальной температуре 30 и 19–20 °С.

Исследуя состояние зимней спячки, в декабре сусликов помещали в индивидуальные клетки, создавая условия, близкие к естественным, и переносили

втемную комнату с температурой 5–6 °С. Учитывая, что у сусликов, в декабре впавших в глубокую спячку (при температуре тела ниже 10 °С), сон не прерывается в течение недели, проводили исследования через день, неделю и месяц после впадения в спячку (температура тела 5–7 °С). В качестве контроля брали бодрствующих живот­ных, находившихся в помещении е температурой 20–22 °С.

Подопытных и контрольных крыс и сусликов декапитировали, быстро вскрывал череп, извлекали большие полушария мозга и определяли в них ферментативную активность. Глутаминазную (КФ 3.5.1.2) активность определяли

вгомогенате ткани больших полушарий мозга, приготовленном на трис-НСl- буфере.

Для определения активности активируемой фосфатом глутаминазы готовили пробы, содержащие 100 мМ Na2HPO4, 100 мМ трис-HCl и 40 мм глутамина Конечный рН 8,5. Активность глутаминазы, не активируемой фосфатом, определяли в смеси, содержащей 100 мМ трис-НСl, 25 мМ малеоната, 1 мМ Na2HPO6, 0,1 мМ КСl и 10 Mк глутамина Конечный рН 7,4. В обоих случаях конечный объем 5 мл.

Контролем служили пробы со всеми добавками без субстрата и пробы, содержащие только глутамин. Опытные и контрольные пробы для определения не активируемой фосфатом глутаминазной активности инкубировали в течение 3 мин при 52 °С чтобы разрушить активируемую фосфатом глутаминазу.

Оглутаминазной активности судили по количеству образовавшегося

впроба аммиака. Трихлоруксусный экстракт (5 %) контрольных и опытных проб центрифугировали и 0,4 мл надосадочно жидкости помещали в отсек флакончика, а во второй отсек – 0,4 мл 50 %-ного раствора К2СО3. Флакончик,

находящийся в горизонтальном положении, осторожно герметически

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 95

мозга и оставляли на 20 мин при комнатной температуре. Пробы, приготовленные на натрий фосфатном буфере (1/15 М) с конечным рН 6,4, содержали

по 12,5 мкМ глутаминовой кислоты, 2,5 мкМ фосфопиридоксаля, 200 мг ткани мозга. Общий объем смеси в мл. О глутаматдекарбоксилазной активности судили по возрастанию содержания гамма-аминомасляной кислоты в инкубационной среде.

Ферментативную активность у животных при низких температурах тела измерили при 37 °С и при температурах, соответствующих температуре тела охлажденного животного (30, 25, 20, 15, 10 и 5 °С). При низких температурах пробы инкубировали в течение 1 ч.

Данные табл. 26 свидетельствуют о том, что активируемая фосфатом­ глутаминазная активность в ткани мозга у интактных (нормотермических) крыс, определенная при температуре инкубации 30, 20 и 10 °С, составляет соответственно 76, 53 и 30 % уровня ее при 37 °С. Для глутаминазной активности, определенной в среде без фосфата, соответствующие величины составляют 50, 47 и 36 %.

Такого же характера изменения, только с некоторыми колебаниями,­ наблюдаются и у животных, охлажденных до 30 и 20 °С.

Как следует из табл. 26, активируемая фосфатом глутаминазная активность в ткани мозга бодрствующих сусликов несколько ниже (на 17 %), чем у контрольных крыс, в то же время глутаминазная активность, измеренная

вотсутствие фосфата, почти одинакова у грызунов­ обоих исследуемых видов. У нормотермических и принудительно­ охлажденных сусликов (температура

тела 30 и 20 °С) активируемая фосфатом глутаминазная активность ткани мозга по мере снижения температуры инкубации понижается так же, как и у крыс. По сравне­нию с крысами у сусликов, охлажденных до 30 °С, не активируемая фосфатом глутаминазная активность в зависимости от температуры инкубации гомогенатов снижается более значительно.

Отмечена различная чувствительность изоформ аргиназы мозга к низкой температуре: активность изофермента с оптимумом­ рН 7,5 в процессе акклиматизации к холоду снижается более резко (на 60 %), чем активность изоформы с оптимумом рН 9,5 (на 40 %).

Глутаматдекарбоксилазная активность в головном мозге крыс при температуре инкубации 30, 25 и 20 °С снижается по сравнению с активностью­

вусловиях инкубации при 37 °С (табл. 27). Со снижением температуры тела до 30 и 20 °С глутаматдекарбоксилазная активность существенно изменяется лишь при 37 °С. Следует отметить, что найденные­ нами изменения активности глутамат-декарбоксилазы у гипотермических­ животных соответствуют изменению содержания в мозге этих животных глутамата и гамма-аминомасляной

кислоты.

96 Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

Таблица 27

Глутаматдекарбоксилазная активность

иткани больших полушарий мозга крыс при гипотермии (в мкмоль ГАМК на 1 г свежей ткани: М±m; n=8–10)

Примечание: – Р— достоверность различий по отношению к контролю (нормотермические животные, инкубация при 37°С), Р1— по отношению к контролю (инкубация при температуре, соответствующей температуре животного).

У сусликов во время зимней спячки глутаминазная и глутаматдекар­бокси­­ лазная активность подвергается изменению в динамике гибернации­ (табл. 28). Так, через сутки и неделю после начала спячки активность­ глутаматдекарбоксилазы в ткани мозга гораздо выше, чем у нормотермических животных (инкубация при 37  °С), к месячному же сроку она несколько снижается, но все же остается выше, чем в контроле. Активность активируемой и неактивируемой глутаминазы в мозге на седьмой день повышается, а через месяц – существенно снижается по сравнению с контролем.

Глутаминаза и специфическая для мозга глутаматдекарбоксилаза проявляют разную температурную чувствительность при искусственном­ и есте-

ственном охлаждении. Во время зимней спячки для глутаматдекарбоксилазной активности температурный эффект (in vitro) отсутствует (табл. 28). При определенных режимах гипотермии глутаминазная и глутаматдекарбоксилазная активность, измеренная при более низкой температуре инкубации, либо выше, либо не отличается­ от таковой при более высокой температуре

(табл. 26–28).

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 97

Таблица 28 Глутаматдекарбоксилазная (в мкмоль ГАМК на 1 г свежей ткани)

и глутаминазная (в мкмоль NH3 на 1 г свежей ткани) активность в ткани больших полушарий мозга сусликов в период зимней спячки

(М±m; n=8–10)

Примечание: р – достоверность различий по отношению к контролю (нормотермические­ животные, инкубация при 37 °С).

Таким образом, наблюдали довольно высокую ферментативную активность в мозге охлажденных­ животных, определенную при низкой температуре инкубации. Следствием изменения ферментативной­ активности является модификация азотистого обмена при охлаждении организма, которая выражается в накоплении аммиака. Очевидно, при низких температурах тела глутаминаза мозга активно­ участвует в регуляции содержания свободного аммиака, глута­ мата и гамма-аминомасляной кислоты. Степень влияния аммиака, глутамата­ на активность глутаминазы мозга путем обратной связи в зависимости от формы

и глубины охлаждения различается.

Обнаруженные нами изменения в активности глутаминазы и глу­ таматдекарбоксилазы отражают одну из сторон пластичности обмена в мозге

при низких температурах тела.

3.18. АКТИВНОСТЬ АРГИНАЗЫ МОЗГА И ПЕЧЕНИ ПРИ ГИПОТЕРМИИ

Для биохимического обоснования метода гипотермии, широко ис­ пользуемого в практической медицине и криобиологии [1], особое значение имеет выяснение адаптивных функций метаболизма теплокровных­ животных при низкой температуре тела. Известно, что одно из выработанных в процессе эволюции приспособлений к экстремальным воздействиям окружающей среды – это зимняя спячка. При такой адаптации наблюдается снижение температуры тела [2], легкая переносимость­ принудительной гипотермии, сходство метаболизма в органах­ и тканях с таковым у адаптированных к холоду и гипотермии гомойотермных животных [3].

Цель работы – исследование содержания мочевины н активность аргиназы в мозге и печени сусликов и крыс при искусственном снижении­ температуры тела, исходя из того, что система аргиназа – моче­вина выполняет адаптогенную функцию при различных экстремальных состояниях [4].

Опыты проводили на лабораторных белых крысах, выращенных­ в виварии проблемной лаборатории Дагестанского университета, и кавказских малых

сусликах (Citellus pygmaeus Pallas), отловленных­ летом 1989 г. на низменностях Дагестана.

Гипотермию у животных вызывали в июне–июле в холодовых камерах с циркулирующей холодной водой (температура 4–5 °С). После 50–60 мин охлаждения животных температура тела при измерении­ ее в ректуме достигала 19–20 °С. В отдельных опытах сусликов охлаждали в течение 2 ч до достижения температуры тела 10 °С, а крыс подвергали в течение такого же времени гипотермии при температуре­ тела 20 °С. Контрольных и подопытных животных декапитировали,­ для исследования брали большие полушария и стволовую часть мозга, а также печень. Активность аргиназы определяли по методике, описанной В. С. Шугалей и Л. С. Козиной [51]. Об активности фермента­ судили по количеству образовавшейся мочевины. Содержание мочевины определяли колориметрически по цветной реакции с диацетилмонооксимом [6]. Активность аргиназы выражали и мкмолях мочевины­ на 1 г ткани за 45 мин.

При глубокой гипотермии (20–10 °С) содержание мочевины в больших полушариях и стволе мозга крыс уменьшается. При дальнейшем­ поддержа-

нии глубокой гипотермии в течение 2 ч содержание мочевины­ в исследуемых

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 99

отделах мозга повышается до контрольного уровня. В печени же крыс количество мочевины не изменяется. У искусственно­ гипотермированных (до 20

и 10 °С) сусликов содержание мочевины в тканях мозга и печени заметно не изменяется (табл. 29).

Таблица 29 Мочевина (мкмоль на 1 г ткани) в мозге и печени животных

при гипотермии (М±m; n = 7–8)

Примечание: здесь и в табл. 30 – различия по отношению к контролю достоверны (р<0,05).

Уровень содержания мочевины в тканях организма определяется не только ее оттоком и деградацией или связыванием с высокомолекулярными­ компонентами клетки [7], но и активностью аргиназы. Поэтому­ особый интерес

представляют данные об активности аргиназы у исследуемых животных при инкубации тканей не только при оптимальной­ температуре (37 °С), но и при охлаждении. При гипотермии (20 °С) в отделах мозга и печени крыс активность аргиназы, измеренная­ при температуре инкубации, соответствующей температуре тела охлажденного животного, увеличивается на 20–40 %. При двухчасовой­ гипотермии (20–19 °С) активность в мозге увеличивается на 60 %. У гипотермированных (до 20 °С) сусликов активность аргиназы как в исследуемых отделах мозга, так и в печени не изменяется. Активность фермента в печени сусликов снижается при принудительном снижении температуры тела до 10 °С (табл. 30).

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что в тканях­ голов-

ного мозга и печени охлажденных сусликов интенсивность синтеза мочевины при низких температурах инкубации сохраняется на высоком уровне. Мы предполагаем, что стабильный уровень содержания­ мочевины в исследуемых органах сусликов при принудительном охлаждении обеспечивается не только высокой активностью аргиназы при низкой температуре, но и замедлением

оттока мочевины.

Активность фермента в мозге и печени у охлажденных крыс (инкубация­ тканей при 37 °С) изменяется. Логично предположить, что снижение активности аргиназы в исследуемых тканях происходит в результате­ прямого действия на нее низкой температуры. Последнее под­тверждается тем, что активность аргиназы мозга у принудительно ох­лажденных сусликов при всех температурах инкубации фермента (10, 20, 37 °С) не отличается от таковой у интактных животных. В то же время у гипотермированных крыс активность аргиназы мозга, измеренная­ при температурах инкубации 20 и 37 °С, существенно превышает­ активность фермента у нормотермических животных.

Таблица 30 Активность аргиназы (мкмоль мочевины на 1 г ткани за 45 мин)

в и печени животных при гипотермии (М±m; n = 7–8)

Обнаруженное нами повышение активности аргиназы в мозге у крыс после пролонгированной гипотермии, видимо, является защитной реакцией, приводящей к восстановлению исходного уровня мочевины, что способствует, в определенной степени, предотвращению дальнейшей­ эндо- и экзопептидазной деструкции белковых молекул [4].

Если учесть, что в механизме активации аргиназы печени существенная­

роль принадлежит гормонам гипофизарно-надпочечниковой системы­ [8], то