Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

УДК 612.82 ББК 28.7 Э55

Печатается по решению редакционно-издательского совета Южного федерального университета

Рецензенты:

доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой биохимии и биофизики

Дагестанского государственного университета И. С. Мейланов; доктор биологических наук, профессор,

зав. кафедрой анатомии, физиологии, гистологии Дагестанского государственного университета М. М. Габибов; доктор биологических наук, профессор,

директор НИИ биологии ЮФУ Т. П. Шкурат

Монография подготовлена и издана в рамках национального проекта «Образование» по «Программе развития федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования

“Южный федеральный университет” на 2007–2010 гг.»

Э55 Эмирбеков Э. З.

Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии / Э. З. Эмирбеков, М. Э. Пашаева,­ А. А. Эмирбекова. – Ростов н/Д: Издательство Южного федерального университета, 2011. – 122 с. – Ил.: 5. Табл.: 33.

ISBN 978-5-9275-0875-4

Вмонографии подытожены результаты исследований большого коллектива авторов ведущей

научной школы по биохимии профессора Эмирбекова Э. З. по влиянию гипотермии на биохимические реакции в головном мозге млекопитающих. Материалы систематизированы и проанализированы

ввиде обзорных статей, а также оригинальных экспериментальных работ, выполненных сотрудниками

всоавторстве, либо без соавторства руководителя научной школы (Львовой С. П., Кличхановым Н. К., Нурмагомедовой П. М., Мейлановым И. С., Эмирбековой А. А., Пашаевой М. Э., Шейховой Р. Г., Халиловым Р. А., Саидовым М. Б., Бекшоковым К. С. и др.).

Вмонографии приводятся экспериментальные данные по оригинальной постановке опытов.

В книге представлена концепция патонейрохимии при гипотермии и дан анализ механизмов влияния

протекторных веществ, создающих щадящие условия нарушений в нейрохимических процессах при охлаждении организма.

Монография представляет интерес для научных сотрудников – биохимиков, физиологов, экологов и врачей, аспирантов и студентов (по направлению биология) университетов и медицинских вузов.

Ил. – 5. Табл. – 33.

введение

Чрезвычайная ситуация для теплокровного организма, которая­ возникает при его переохлаждении, также как и воздействие­ любого внешнего фактора, прежде всего сказывается на функции головного мозга. Изучение метаболизма мозга во время­ развивающегося гипотермического состояния, при различной длительности и повторности, а также при выходе из него впол­не соответствует задачам функциональной биохимии головного мозга [36], которые заключаются­ в выяснении связи между специфическими функциями нервной системы и особенностями химического строения и обмена­ вещества в ней.

Следует отметить, что хотя обмен веществ при охлаждении животного организма­ издавна является предметом физиологических и биохимических­ исследований, состояние метаболизма в мозговой ткани при гипотермии до сих пор мало изучено. Ученые при изучении метаболизма гипотермических состояний уделяли прежде всего углеводно-фосфорному обмену [1–4].

Интерес диктовался тем, что углеводно-фосфорный обмен является главным источником генерирования энергии для деятельности­ клеток и претерпевает наибольшие изменения при гипотермии. По сравнению с другими тканями головной мозг отличается значительно большим поглощением кислорода и вы­ сокой чувствительностью к его недостатку [4, 7, 16, 24, 34, 38, 43, 45]. Многие авторы указывают, что в основе патогенеза общего охлаждения лежит противоречие, конфликт между кислородным запросом и условиями удовлетворения при снижении температуры­ тела. Установлено, что уже в начальный период охлаждения животного (до 27 °С) окислительные процессы в мозговой ткани значительно снижаются и удерживаются на низ­ком уровне на всех этапах охлаждения. Потребление кислорода мозгом прямо пропорционально температуре тела [93].

При снижении температуры тела животного значительные изменения возникают и в белковом обмене головного мозга.

Г. Е. Владимиров [2] обнаружил чрезвычайно резкое­ снижение интенсивности аминокислотного обмена (на при­мере глицина, метионина и тирозина). Так, скорость обновле­ния тирозина в белках мозга при температуре тела 20 °С снижается­ почти в 20 раз по сравнению с нормотермией.

Физическое охлаждение кроликов (на 8,4 °С) также сопровождается­ значи-

тельным снижением (18 %) интенсивности обновления­ белков серого вещества

больших полушарий мозга. Об интенсивности обновления белков автор судил по включению метионина-S35 через 3,5–4 часа после введения­ его под кожу.

А. С. Коникова и др. [24] установили, что при гипотермии, полученной­ фармакологическими средствами и искусственным охлаждением­ льдом, почти во всех тканях организма, в том числе и в центральной нервной системе снижается интенсивность синтеза­ белков. По результатам исследований М. П. Явич [63], при искусственном­ снижении температуры тела до 24–23 °С обновление белков мозга снижается (в 4 раза), в то время как наркотическое торможение на этот процесс не оказывает существенного влияния­.

Литературные материалы свидетельствуют о том, что при гипотермии обновление веществ, входящих в структурные образования­ клеток (например, белки), тормозится несравненно резче,­ чем обновление веществ, имеющих энергетическое значение.

Значительное понижение процессов распада и синтеза бел­ка обусловливает возможность сохранения белковых структур в условиях недостатка энергии, в частности, при кислородном голодании­ [39].

Не останавливаясь подробно на различных видах обмена мозга при гипотермии, описанных в литературе, можно сказать, что и в центральной нервной системе животного при ох­лаждении происходят значительные биохимические изменения. Однако эти изменения не всегда достаточно ярко выражены и в большинстве случаев не объясняют полностью механизма расстройств­ деятельности центральной нервной системы при охлаждении­ организма.

Определением прижизненного содержания в нервной ткани продуктов

белкового метаболизма, а также изучением неразрывно­ связанного с белками обмена аммиака, глутаминовой кислоты, глутамина и т. д. можно судить о состоянии белковых ве­ществ. Содержание в белках амидных и других функциональных групп характеризует их физико-химические свойства.

Вэтом отношении, на наш взгляд, особого внимания за­служивает изучение изменения важнейшей системы мозга – системы­ освобождения и связывания аммиака при гипотермии на различных этапах, при различной длительности

имногократности­ ее. Изучение динамики аммиака в мозговой ткани – «прек­ расного биохимического индикатора функционального состояния мозга» – весьма важно для выяснения хода биохимических процессов, протекающих в мозге при снижении температуры тела.

Впоследние годы внимание исследователей все больше привлекает азотистый обмен в мозге. Исходя из эволюционной роли аммиака и лабильных аммиакобразующих соединений, исследование­ их динамики важно для познания функциональной биохимии органа.

При изучении состава и обмена веществ в мозге в момент определенного

функционального состояния, особенно обмена лабильных соединений, очень

большое значение имеет способ умерщвления и фиксирования процессов обмена

вмозге животного­. В конце 40-х годов 20 столетия как отечественными, так и зарубежными учеными было показано, что замораживание тканей мозга, как любого другого органа, жидким воздухом (–180 °С) приводит к исключению посмертных изменений и выявляет истинное содержание таких лабильных компонентов, как аммиак и макроэргические фосфаты. Дело в том, что замораживание полностью останавливает ферментативные процессы. Было обнаружено, что в мозге целиком замороженных крыс содержание свободного аммиака составляет 0,28–43 мг %. Обзор таких работ приведен в монографии Э. З. Эмирбекова [51].

Влаборатории Г. Е. Владимирова [2] сконструировали специальную камеру для мгновенного погружения животного в жидкий кислород и определяли содержание аммиака в мозге крыс в среднем 0,36 мг %. А в лаборатории З. С. Гершеновича [10] в мозге целиком­ замороженных крыс обнаружили 0,3 мг % (0,12–0,68) свободного аммиака (среднее из 60 определений).

Всякое воздействие на организм, а также патологические процессы,­ сопровождающиеся нарушением деятельности центральной нервной системы, приводят к изменению содержания аммиака в мозге.

Серия экспериментов демонстрировала факт о том, что в головном мозге в состоянии возбужде­ния увеличивается содержание аммиака, а в покое и при вве­ дении тормозящих веществ (бромистого натрия и уретана) содержание­ аммиака уменьшается. Таким образом, было установлено, что аммиак является показателем функциональной­ деятельности центральной нервной системы. Нормальная­ деятельность мозга, т. е. процессы условного и безусловного­ возбуждения и тор-

можения, всегда сопровождается изменением количества аммиака в мозге. Увеличение содержания аммиака при возбуждении и устранении­ при

торможении, при воздействии фармакологических ве­ществ было подтверждено и другими авторами [51]. Большое значение аммиака в обмене веществ головного мозга­ доказывается и тем, что многие экстремальные состояния сопровождаются увеличением продукции аммиака и замедлением­ его устранения

вмозге. Явление шока, вызванное электрическим­ раздражением, действие им­ пульсных ускорений, интоксикация кислородом, а также рядом веществ приводят к увеличению содержания аммиака в головном мозге животного в 5–15 раз. Следовательно, осуществление функций нервной системы происходит благо­ даря быстро протекающим регуляторным биохимическим реакциям.

Особую роль аммиака в процессах нервной деятельности можно понять, по-видимому, из следующего: реакции, в которых он участвует, многообразны; аммиак сыграл важную роль в становлении обмена веществ. Молекула аммиака имеет форму треугольной пирамиды с атомом азота на вершине. Она харак­ теризуется значительной полярностью благодаря сильному сме­щению электро-

нов связи N–Н от водорода к азоту. Поэтому аммиак более чем другие газы

растворим в воде. При 20 °С в одном­ объеме воды растворяется 700 объемов, при 0–1200 объемов­ аммиака. Для биологических процессов важное значение

имеет его большая растворимость и проницаемость через мембраны­. Все это определило роль аммиака в осуществлении ряда биохимических процессов в ходе эволюционного развития живого.

Благодаря своим свойствам, на ранних этапах развития жизни­ в водной среде (первичном бульоне) аммиак, в зависимости от концентрации, диффундировал из среды в предбиологические системы, а впоследствии участвовал в синтезе сложных азотсодержащих веществ и регуляции внутриклеточных процессов. У многих современных пресноводных организмов аммиак является­ конечным продуктом азотистого обмена, свободно перемещаясь­ из организма в окружающую водную среду. Так, костистые­ пресноводные рыбы выделяют главным образом аммиак и незначительное количество мочевины.

Благодаря легкости взаимодействия с карбоксильными груп­пами белков, он несомненно является модификатором и регулятором­ физико-химических,

аследовательно, физиологических свойств белков.

Впроцессе эволюции живого у подавляющего большинства видов прекратилась свободная диффузия аммиака во внешнюю среду и возникли механизмы, резервирующие и регулирующие его уровень в тканях.

Изменение уровня аммиака в мозге происходит с большой, можно сказать, «взрывной» скоростью. Спустя 1 сек после обезглавливания животного содержание аммиака в мозговой ткани возрастает до 0,47 мг % (против 0,28 мг % в норме); при­мерно такое же увеличение содержания его наблюдается при электрическом раздражении мозга в течение 1 сек. Возможности образования аммиака в головном мозге весьма велики, что находится в известном противоречии с постоянством содержания его в мозговой ткани в норме in vivo. Концентрация аммиака в мозге каким-то путем регулируется.

Изолированный спинной мозг лягушки не отвеча­ет повышенным образованием аммиака при раздражении электрическим­ током. Это явление объясняется тем, что, по-видимому, в центральной­ нервной системе аммиак связывается.

Реальное существование механизма связывания аммиака в ткани мозга в последующем было доказано экспериментально. Оказалось, что срезы моз­

говой ткани in vitro в аэробных условиях и при наличии в среде глюкозы могут из аммиака и глутаминовой кислоты синтезировать­ глутамин. Из мозга был выделен энзим, катализирующий синтез глутамина из аммиака и глута­мата с использованием энергии АТФ.

Однако после плавания в мозге крыс концентрация аммиака не повышается. Следовательно, можно думать, что аммиак, который выделяется во время

функциональной активности нервной клетки, связывается с глутаминовой­ кислотой, которая содержится в мозге в больших концентрациях­.

Нервная ткань в организме выполняет особые функции. Она первая реагирует и отвечает за максимально короткий срок на многочисленные внешние воздействия. Информация, которая поступает­ в головной мозг, перерабатывается в итоге в системы химических реакций. Эта переработка, реализация и хранение информации осуществляются превращениями биоорганического субстрата. Во всех разнообразных процессах и явлениях живого есть, повидимому, общая основа: главный химический субстрат и источник энергии. В настоящее­ время есть достаточные основания считать, что материальной­ основой нервных процессов являются белковые вещества. Первичным рецептором в мозге являются белковые молекулы с их разнообразием свойств и исключительной физической­ и химической подвижностью, определяющие все стороны жизнедеятельности нервной клетки.

И в нервной ткани следует ожидать наличие быстро и сложно действующих механизмов освобождения и связывания аммиака. Механизмы эти должны отвечать многим жестким условиям: быть чрезвычайно лабильными, в известной степени независимыми­ от других химических реакций в мозге и, что может быть наиболее важно, взаимозаменяемыми.

Уровень современных знаний позволяет предположить, что весь ход промежуточного азотистого обмена (оставляя в стороне некоторые специальные аспекты и синтез белка) направлен на то, чтобы регулировать содержание аммиака в клетке на уровне, необходимом для сообщения белкам определенных физикохимических свойств, соответствующих данному функциональному­ состоянию.

В ткани мозга также следует ожидать наличие соединений, стоящих на стыке путей метаболизма. Наличие «стыковых» ве­ществ упрощает способ переработки информации и унифицирует метаболический ответ на разного рода воздействия среды. В системе переработки информации действуют обратные связи, регулирующие скорость и направление пути системы. Такими свойствами обладает система глутамат – γ-аминомасляная кис­лота и сопряженные с ней превращения. Последняя, кроме того, как будет показано ниже, является одним из фрагментов системы­ освобождения и связывания аммиака в мозге.

Сравнительные исследования обнаружили сходные черты­ азотистого метаболизма мозга у некоторых групп микроорганизмов­. Только в мозговой ткани

различных представителей животного мира [51] и у некоторых микроорганизмов обнаружены высокие концентрации γ-аминомасляной кислоты и, соответственно, специфически­ активная декарбоксилаза глутаминовой кислоты.

Только микроорганизмы и мозг содержат больше глутаминовой­ кислоты, чем прочие организмы и другие ткани живот­ных [51]. Обнаружено, что метаболизм ионов аммония у дрожжей у Bacillus brevis и в мозгу контролируется НАД,

и НАДФ-зависимыми глутаматдегидрогеназами. Кроме того, специфическим субстратом для нервной ткани и микробной клетки является ацетил-аспараги­

новая кислота. Все это несомненно связано с особенной­ направленностью азотистого обмена.

Одноклеточные организмы обладают определенной автоном­ностью. Они самостоятельно реагируют на все воздействия внешней­ среды. Такую же роль выполняет нервная система в многоклеточном­ организме. Отсюда и сходство метаболизма нейрона и одноклеточного организма.

Имеющиеся литературные сведения свидетельствуют о некоторой об­ щности механизма аммиакообразования в различных тканях и органах. Однако наряду с этим существуют указания на то, что даже в одном органе – головном мозге – наблюдаются отличия в самом механизме процесса (а не только в его интенсивности),­ зависящие от состояния объекта и рода воздействия. Система освобождения и связывания аммиака в головном мозге коррелируется с метаболическими процессами, в которых участвуют многие азотистые соединения. Обмен аммиака выражает суммарный эффект циклических, обратимых реакций, где начало одновременно­ является концом процесса [23].

Основные механизмы метаболизма аммиака состоят из системы:­ дикарбоновые аминокислоты, аммиак, амиды аминокислот,­ межмолекулярный перенос его радикала и реакции синтеза­ мочевины.

При анализе литературных материалов выяснено, что главными­ потенциальными источниками аммиака в головном мозге являются: адениловая система, система глутамин – глутаминовая кислота и амидные группы белков.

Анализ литературных материалов в работе Э. З. Эмирбекова [51] показывает, что в мышечной ткани источником аммиака является адениловая система. Присутствие адениловой кислоты в мозговой­ ткани свидетельствует, что освобождение аммиака в мозге in vitro также происходит из адениловой системы. Адениловая кислота не является единственным источ­ником аммиака в мозге: в срезах мозга и в цельном мозге прирост аммиака не покрывается дезаминированием адениловой системы. Ссылаясь на эти данные и на то, что в мозге активность дезаминазы адениловой­ кислоты низка по сравнению с другими органами, можно предположить, что возможность образования аммиака из адениловой кислоты вo время функциональной активности­ нервной ткани исключается.

П. А. Кометиани [23] в новом аспекте устанавливает участие аде­ниловой

системы в продукции аммиака в мозге. Адениловая кислота­ в нервной ткани может аминироваться за счет аминных групп глутаминовой и γ-аминомасляной кислот. Эти аминокислоты передают аминную группу кетокислоте, и образуется аспарагиновая кислота, которая принимает участие в ресинтезе адениловой­ системы. Адениловая система в данном случае­ играет роль насоса, перекачивающего аминную группу аминокислот­ на аммиак.

Многочисленными исследованиями как отечественных, так и зарубежных авторов показано, что с обменом аммиака в мозге теснейшим образом связана

система глутаминовая кислота – глутамин.

Анализ источников литературы, приведенных в работе [51], позволяет предположить образование аммиака в мозге из глутамина. В опытах на целостном­ организме было показано уменьшение глутамина в мозге в первые секунды условнорефлекторного, безусловнорефлекторного и медикаментозного возбуждения. Прирост­ аммиака в мозговой ткани сопровождается уменьшением содержания глутамина при кислородной интоксикации, при гипотермии, при умирании от кровопотери, при действии на организм импульсных ускорений и т. д.

По количественному содержанию глутамина мозг стоит на первом месте среди других органов животного. Образование аммиака из глутамина в мозговой ткани доказано­ многими работами.

Освобождение аммиака из глутамина осуществляется двумя путями. Первый путь прямого гидролитического отщепления аммиака­ от глутамина в ткани мозга был открыт Кребсом и катализируется ферментом глутаминаза. Впоследствии были изучены свойства фермента, названного глутаминазой- I. Она активируется ионами фосфата, в меньшей степени­– арсенатом и сульфатом. Глутаминовая кислота полностью­ угнетает данную реакцию в мозге,

атакже в сетчатке глаза, селезенке, но не в печени. Оптимум действия глутаминазы мозга рH 8–9. На основании этого можно сделать вывод, что объем дезамидирования глутамина с участием глутаминазы-I невелик и она не играет существенной роли в освобождении аммиака и мозге.

По-видимому, главным путем освобождения аммиака в ткани мозга из глутамина является путь, катализируемый ферментом­ – глутаминазой-II. Глутаминаза-II активируется­ пируватом и другими кетокислотами.

Реакция сочетанного трансаминирования-дезамидирования глутамина является необратимой и наиболее характерной для ткани мозга.

Распад аспарагина, хотя и обнаружен в нервной ткани, но практически не может играть заметной роли, во-первых, из-за низкой активности аспарагиназы, а во-вторых, из-за малого содержания аспарагина.

Ряд исследователей [51] в качестве возможного источника аммиака­ в головном мозге считают глутаминовую кислоту. Из всех аминокислот только глутамат интенсивно окисляется нервной тканью. Больше 50 % поглощенного срезами­

коры мозга кислорода расходуется на окисление глуминовой кислоты. Было установлено наличие в мозге дегидрогеназы глутаминовой кислоты (КФ 1.4.1.2).

Действие глутаминодегидрогеназы при нормальном клеточном­ окисли­ тельно-восстановительном потенциале смещено в сторону синтеза глутамата,

ане освобождения аммиака (при рH 7,4 окисляется только 1,4 % глутаминовой кислоты). Ско­рость реакции составляет 400 мкмоль/час. Равновесие реакции

устанавливается лишь при наличие ионов аммония. Следовательно,­ аммиак регулирует ход окисления глутаминовой кислоты­. Здесь ясно проявляется тесная связь обмена аммиака с окислительными превращениями глюкозы, как источника α-кетоглутаровой кислоты – предшественника глутамина.

Наиболее важной стороной функции глутаматдегидрогеназы является поддержание определенного уровня аммиака в мозге.

Расчеты показывают, что окисление глутаминовой кислоты в срезах мозга не соответствует освобождению свободного аммиака. По-видимому, затраты глутаминовой кислоты в гомогенатах мозга обусловлены реакциями трансаминирования и дезкарбоксилирования, и поэтому ряд авторов считают, что глутаминовая кислота не может играть роль источника свободного аммиака. «Аминная группа глутаминовой кислоты может освободиться в виде аммиака через глутамин» [23].

Можно думать, что, глутамат­ не может играть роль источника образования аммиака при его функциональной деятельности.

Литературные материалы позволяют предложить, что глутамат и его безазотистый предшественник α-кетоглутарат занимают центральное место в азотистом метаболизме мозга. Эти соединения создают возможность многократного, экономного использования аммиака. Превращение всех других аминокислот проходит в сопряжении с реакциями дезаминирования и трансаминирования глутаминовой кислоты. Их называют реакциями трансдезаминированиятрансреаминирования.

Вмозге эти реакции имеют первостепенное значение в процессах­ устране-

ния аммиака: аминогруппа глутамата переносится на кетокислоты, давая начало новым аминокислотам и освобождая­ α-кетоглутаровую кислоту для новых взаимодействий со свободным аммиаком.

Другой механизм связывания аммиака также происходит с участием глутаминовой кислоты. γ-карбоксил глутамат амидируется с образованием глутамина. Реакция синтеза глутамина катализируется ферментом глутаминсинтетазой (КФ 6. 3. I. 2.). Как и другие реакции метаболизма глутамата, реакция синтеза глутамина наиболее интенсивно проходит в мозге млекопитающих. Реакция эта является эндотермической и идет стехиометрическию.

Впоследние годы выяснено, что в устранении аммиака в мозговой ткани участвует γ-аминомасляная кислота, которая образуется декарбоксилирова­ нием глутаминовой кислоты. Добавление γ-аминомасляной кислоты к срезам мозга крысы при рH 7,4 приводит к статистически достоверному меньшему накоплению аммиака по сравнению с контрольными пробами.

Вработе [51] подвергаются обзору литературные материалы об участии в системе освобождения системы освобождения и связывания аммиака в моз-

ге γ-аминомасляной кислоты. γ-аминомасляная кислота усиливает с одной