Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

Заключение

Актуальность экспериментального исследования механизмов действия низкой температуры на гомойотермных животных вытекает из необходимости применения гипотермии в медицинской практике и экспериментальной биологии.

Главным требованием к методу гипотермии является обеспечение таких условий, при которых потребности организма соответствовали бы его изменившимся возможностям. Такие щадящие условия организму может создать лечебная гипотермия, проводимая на фоне частичной блокады терморегуляции.

При изменении температуры окружающей среды у гомойотермных животных развиваются как специфические терморегуляторные изменения, направленные на сохранение температурного гомеостаза, так и неспецифические стрессорные изменения, обусловленные действием холода как чрезвычайного раздражителя. Снижение температуры тела гомойотермного организма приводит к значительным изменениям показателей гемодинамики и микроциркуляции, создавая основу для замедления регионального кровотока и вызывая нарушение функций сердца, головного мозга и других тканей и органов.

Прямые доказательства нарушения функции головного мозга получены

в исследованиях его электрической активности при охлаждении ненаркотизированных животных. У млекопитающих головной мозг наиболее чувствителен к снижению температуры тела и нормально функционирует в более узком диапазоне температур, чем другие ткани [10]. Выраженное расстройство поведения и другие неврологические нарушения при охлаждении гомойотермного животного в своей основе имеют метаболические сдвиги в соответствующих отделах головного мозга. Известно, что даже при глубокой гипотермии (ректальная температура 20–17 °С) головной мозг животных не испытывает недостатка в энергетическом субстрате, кислород находится в избытке и резкое уменьшение его потребления связано не с уменьшением доставки, а понижением потребности мозга в энергии [5]. Гипоксия развивается в ткани головного

мозга лишь в терминальной стадии гипотермии (ректальная температура ниже 20–17 °С), являясь либо непосредственной причиной смерти при замерзании, либо усугубляя холодовое угнетение функций организма.

В условиях гипотермии около 75 % энергетических потребностей обеспечивается окислением жирных кислот и примерно 10 %-окислением глюкозы

[20]. Высокие концентрации жирных кислот блокируют фосфорилирование

глюкозы и ингибируют последующий гликолиз, поэтому глюкоза периферическими органами и тканями утилизируется мало.

По данным нашей лаборатории при умеренной гипотермии (30  °С) в мозге крыс возрастает интенсивность гликолиза, о чем свидетельствуют снижение концентрации АТФ (на 21 %) и креатинфосфата (на 39 %) и уменьшение количества гликогена и глюкозы, сопровождающееся значительным увеличением содержания молочной кислоты. Напротив, содержание глюкозы, креатинфосфата, АТФ в головном мозге крыс, гипотермированных до 28–30 °С, повышается после 3-часового пролонгирования. При глубокой гипотермии (20–19 °С) интенсивность анаэробного и аэробного гликолиза в мозге крыс снижается,

ауровень глюкозы, молочной кислоты и макроэргических фосфатов увеличивается. Изменение в содержании компонентов энергетического обмена в мозге крыс при гипотермии, по-видимому, определяется активностью окислительных ферментов, а также степенью сопряженности фосфорилирования с дыханием, которая регулируется уровнем содержания жирных кислот и продуктами­ перекисного окисления липидов.

Мобилизация энергетических субстратов опосредуется общими механизмами (катехоламины – аденилатциклаза – циклический АМФ – протеинкиназа – липаза – фосфорилаза). При гипотермии ингибируется выделение вазопрессина, являющегося медиатором холодового диуреза, а аргинин-вазопрессин известен как важный медиатор двух физиологических ответов при гипотермии; во-первых, минимизации энергетического потребления, во-вторых, ингибирование секреции, которая приводит к появлению гипотермического диуреза.

Не подлежит сомнению ключевая роль биологических мембран в поддержании клеточного метаболизма при охлаждении. Клеточные мембраны эндотермных животных адаптировались для балансирования метаболизма в диапазоне нормотермии (38±4 °С). Гипотермия снижает проницаемость цитоплазмы и клеточных мембран, а индуцированные охлаждением фазовые переходы липидов из жидкокристаллического в гель-состояние ведут к образованию значительно более жесткой мембранной структуры, пластичность которой резко изменяется [17]. Структурные изменения мембран, обусловленные фазовыми переходами липидов, отрицательно влияют на состояние клеток, приводя к деформации плазматической мембраны и мембран внутриклеточных органелл,

атакже к нарушению работы мембранносвязанных белков.

Снижение содержания холестерина в мембранах аксонов сопровождается увеличением проницаемости мембраны и возникновением процесса возбуждения при гипотермии [21]. Можно думать, что изменение содержания­ холестерина и, следовательно, изменение фазовых свойств мембранных липидов может быть основой повышения функциональной активности ЦНС в ответ на

быстрое кратковременное охлаждение [8].

«Структурная» адаптация, способствующая поддержанию жидкокристаллического состояния мембран в более широком диапазоне температур, обеспе-

чивает и нормальное функционирование синапсов, что особенно важно в гипоталамусе – главном центре регуляции всех вегетативных функций организма.

Вто же время повышение ненасыщенности жирных кислот создает более благоприятные условия для перекисного окисления липидов, так как свободнорадикальному окислению подвергаются в основном ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав фосфолипидов.

Продукты перекисного окисления липидов на ранних стадиях охлаждения активируют ряд мембранных ферментов. На более поздних этапах охлаждения окисление ненасыщенных жирнокислотных остатков липидов существенно модифицирует структурно-функциональную целостность мембран, ингибирует активность мембранносвязанных ферментов, что, вероятно, обусловлено образованием межмолекулярных сшивок между продуктами окисления липидов и мембранами

[9].На этом основании перекисные процессы занимают важное место в молекулярных механизмах повреждающего действия холодового фактора.

Вмодификации белков тканей, в том числе мозга, при гипотермии существенную роль играют процессы их окислительной активности.

Внашей лаборатории [13] установлено, что при гипотермии в различных тканях крыс снижается окислительная модификация белков и повышается антиоксидантная активность. Известно, что модифицированные белки подвергаются агрегации, фрагментации, а также протеолизу.

При более длительном действии низких температур обнаружены изменения

физико-химических свойств белков мозга, за счет чего происходит их перераспределение между различными субклеточными фракциями. Так, количество белка в митохондриальной и лизосомальной фракциях заметно уменьшается, в «промывной» фракции увеличивается, а в цитоплазматической и ядерной не меняется, хотя общее содержание водорастворимых белков мозга при этом снижается.

При охлаждении теплокровного животного выявлены изменения таких физико-химических свойств белков мозга, как электрофоретическая подвижность, растворимость, гидрофобные и гидрофильные показатели, аминокислотный состав, количество и качество амидных и сульфгидрильных групп. Следствием этих изменений, видимо, является разнонаправленность обнаруженной при гипотермии и зимней спячке зависимости от температуры активности глутаминазы, глутаминсинтетазы, аминотрансфераз, АТФ-аз, ацетилхолинэстеразы и др.

Как вторичный эффект действия холода вследствии изменения реактивности некоторых функциональных групп наступают конформационные превращения белковой молекулы. Уже на первых этапах гипотермии в суммарных

и водорастворимых белках мозга наблюдается изменение в соотношении

лабильных и прочносвязанных амидных групп. Глубокая гипотермия (20–19 °С) сопровождается равномерным снижением количества амидных групп обеих

фракций белков мозга, что увеличивает атакуемость белков протеолитическими ферментами и, следовательно, уменьшает время полужизни белков. Действительно, активность кислых пептидгидролаз в мозге при гипотермии значительно повышается, что влечет за собой снижение содержания белка.

Устойчивость клеток к низким температурам определяется стабильностью белков, которая зависит от соотношения дисульфидных связей и свободных сульфгидрильных групп в структуре белковых молекул. Повышенное содержание сульфгидрильных групп в водорастворимых белках мозга, найденное при умеренной гипотермии, уменьшается при охлаждении крыс до 20–19 °С. Увеличение SН-групп в белках при умеренной гипотермии, видимо, связано с денатурационными изменениями, в результате которых освобождаются тиоловые группы, ранее скрытые внутри молекулы.

Действительно, уменьшение количества SН-групп при глубокой гипотермии обусловлено отрицательным действием малонового диальдегида на активные центры ферментов, функционирование которых во многом определяется состоянием SН-групп.

При искусственной адаптации к низкой температуре тела подобная картина не наблюдается, поэтому можно думать, что в этих условиях в основе температурной модификации большинства белков лежит процесс не изменения гибкости, а влияния модуляторов.

В работах нашей лаборатории исследовано влияние таких модуляторов, яв-

ляющихся естественными метаболитами мозга, как гомокарнозин, путресцин, мочевина, аргинин, спермин. При их предварительном введении животным гипотермия вызывает такие изменения в динамике метаболизма белков, ферментов, амидных групп белков, интенсивности ПОЛ. В опытах in vitro действительно подтверждается модулирующее влияние исследованных­ нейроактивных веществ на биохимические процессы в мозге при гипотермии. При гипотермии происходит снижение синтеза белка. Интенсивность обмена белков мозга при гипотермии теплокровного организма снижается прямо пропорционально снижению температуры тела [19].

Как следствие изменения биосинтеза белков и активности протеолитических ферментов при низких температурах тела обнаружено изменение аминокислотного состава суммарных белков мозга. При гипотермии крыс белки мозга переходят из одной фракции в другую вследствие изменения физико-химических свойств. Снижение интенсивности включения аминокислот в белки мозга при гипотермии, по-видимому, обусловлено изменением структуры и функции полирибосом, а также структуры белков-ферментов,

катализирующих процессы синтеза белковых молекул. Так, в мозге крыс

при 2- или 3-часовой глубокой (20 °С) гипотермии наблюдается повышение активности трансаминаз. Напротив, в гомогенатах мозга при температуре ин-

кубации, равной 30 °С, активность ГАМК-α-кетоглутарат-аминотрансферазы снижается.

Следствием глубоких изменений свойств белков-ферментов при гипотермии являются сдвиги в уровне многих низкомолекулярных азотсодержащих соединений, в том числе моноаминов и аминокислот, нарушения метаболизма которых в мозге при гипотермии неизбежно приводят к расстройствам функций ЦНС, поскольку именно эти соединения помимо нейромедиаторных функций принимают активное участие в процессах терморегуляции.

Поскольку на холоде усиливается выделение кортикотропных гормонов, влияющих на обмен катехоламинов как в надпочечниках, так и в ткани головного мозга, то при охлаждении происходит активация центральных адренергических структур, что сопровождается высвобождением катехоламинов. Так, синтез и распад серотонина в мозге крыс усиливается при действии тепла

иснижается при холодовом воздействии, а его внутривенное введение вызывает гипотермический эффект [2].

Изменение концентрации любого из компонентов глутаминового цикла ведет к резким сдвигам в образовании и утилизации аммиака, рост содержания которого зарегистрирован как во время первичной реакции организма на охлаждение, так и по мере углубления гипотермии [12]. Причиной описанных изменений авторы считают наблюдаемое при снижении температуры тела крыс падение уровня глутамина, аспарагиновой кислоты и ГАМК в головном мозге

ирост количества глутаминовой кислоты.

Анализ литературных данных показывает, что в головном мозге охлажденного организма сдвиги в содержании ГАМК, глутамина, глутаминовой

иаспарагиновой кислот являются результатом изменения энергетического

инейромедиаторного обмена, а также следствием изменения скорости синтеза

ираспада тканевых белков [3].

Значительные изменения содержания нейротрансмиттеров (глутамата, аспартата, аланина, ГАМК, таурина и моноаминов) при гипотермии [14] свидетельствуют о влиянии низкой температуры на эффективность синаптической передачи, полное блокирование последней наступает при охлаждении организма до 25 °С [10]. Причиной такого блокирования скорее всего является наблюдаемый при низкой температуре мозга процесс аккумулирования нейромедиаторов синаптосомами [15]. Кроме того, в мозге крыс обнаружены чувствительные к холоду синаптосомы [4], нарушение в работе которых при охлаждении скорее всего обусловлены изменением транспорта Са2+.

Для выяснения возможных механизмов влияния низкой температуры

на эффективность синаптической передачи нами были проведены серии

экспериментов по изучению поглощения мозгом из крови меченых аминокислот, таких как фенилаланин, лейцин, лизин, глутамат и ГАМК [18]. Было уста-

новлено, что при гипотермии не происходит изменения капиллярного транспорта воды и указанных веществ. Опыты с изолированными капиллярами мозга подтверждают результаты исследований in vivo [12]. Напротив, на срезах мозга гипотермированных крыс установлена температурная зависимость поглощения меченых аминокислот (фенилаланина, лейцина, глутаминовой кислоты, аргинина, лизина и ГАМК). Таким образом, при поиске механизмов влияния низкой температуры на эффективность синаптической передачи особое внимание следует уделять транспортным процессам в контактах нейронглия, нейрон-нейрон, поскольку в капиллярном транспорте аминокислот температурная зависимость отсутствует, а на срезах мозга она установлена.

Анализ данных литературы дает основание предполагать, что такие метаболические нарушения при гипотермии гомойотермных животных, как усиление свободнорадикального окисления липидов и повышение атакуемости белков протеолитическими ферментами в биологических мембранах, а также сдвиги в использовании макроэргических веществ могут стать причиной улътраструктурных перестроек нейрональных и глиальных компонентов, что подтверждается наличием серьезных постгипотермических осложнений вплоть до гибели подопытных животных даже в сравнительно отдаленные сроки после перенесенной гипотермии. Это наше предположение подтверждается данными электронномикроскопических морфометрических исследований о структурных нарушениях в гепатоцитах белых крыс, подвергшихся длительному воз-

действию холода [11].

Таким образом, чувствительность центральной нервной системы к гипотермии вытекает из нарушения структурной и биохимической интеграции мозга. Действие гипотермии можно представить в виде следующей концепции: нарушение микроциркуляции, снижение использования высокоэнергетических веществ, необходимых для поддержания ионной, транспортной

ибиосинтетической интеграции, блокирование холодом полисинаптических нейрональных путей, расстройство мембранно-синаптической трансмиссии, модификация и нарушение мембран перекисным окислением липидов

ивзаимоотношения липопротеиновых комплексов в мембранах, дискоординация активности ферментов, изменение соотношения­ углеводно-фосфорных

иазотистых метаболитов. Обнаруженные изменения обменных процессов мозга при гипотермии отражают резерв­ные возможности регуляторных процессов центральной нервной системы­ и открывают перспективы расширения устойчивости теплокровного организма к гипотермии путем химического вмешательства, а также путем использования адаптивных функций мозга при

низких температурах­ тела.

Литература

1.Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. М.: Наука, 1982. 151 с.

2.Арутюнян Р. А., Саакова Л. А., Хачатрян Д. К., Саакян Г. Х., Арутюнян К. Р.

Участие норадренергических структур в серотониновой регуляции температурного гомеостаза организма // Биол. ж. Армении. 1990. 43, N 10–11. С. 898–902.

3.Березин В. А., Велик Я. В. Специфические белки нервной ткани. Киев: Наукова думка, 1990. 264 с.

4.Блай Д. Является ли центральный контроль постоянства температуры примером гомеостазиса // Физиол. ж. СССР. 1981. Т. 67, N7. C. 1068–1078.

5.Иванов К. П. Биоэнергетика и температурный гомеостазис. Л.: Наука, 1972. 173 с.

6.Ковтунова М. Е., Селезнева О. М., Ворожцова С. И., Куноф В. К. Влияние криоконсервирования тромбоцитов на уровень полиаминов и активность катепсина Д // Вопр. мед. химии. 1992. 38, Ш. С. 33–36.

7.Крепс Е. М. Липиды клеточных мембран. Л., 1981. 339 с.

8.Кубарко А. И. Системная регуляция и физиология фазовых состояний липидов организма: Автореф. дис.канд. мед. наук. Минск., 1984. 47 с.

9.Меерсон Ф. З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. М.: Медицина, 1984. 290 с.

10.Проссер Л. Температура. Сравнительная физиология животных. т. 2. М.: Мир, 1977. С. 84–209.

11.Филюшина Е. Е., Шмерлинг М. Д., Бузуeва И. И. Ультра-структурная характеристика гепатоцитов при адаптации к холоду в природных условиях //

VII Всерос. симп. «Эколого-физиологические проблемы адаптации», 26–28 апреля, 1994, Москва. С. 287.

12.Эмирбеков Э. З. Функциональная нейрохимия. Махачкала: Дагестанский ун-т, 1980. С. 126.

13.Эмирбеков Э. З., Кличханов Н. К., Эмирбекова А. А. Роль липидов в адаптивной перестройке мембран при зимней спячке // Научная мысль Кавказа. 2004. Т. 39, №3. С. 166–173.

14.Эмирбеков Э. З., Львова С. П. Нейрохимические изменения при зимней спячке // Нейрохимия. 1984. Т. 3, № 3. С. 306–317.

15.Вакеr R., Vilhard Н., Норе D. Соld induced of hormone and proteins from nerve endings isolated from bovine neural lobes // J. Neurochem. 1975. v. 24. N 5. Р. 1091–1093.

16.Сhance B., Sies H., Воveris А. Нуdroperoxide metabolism in mammalian organs // Physiol. Rev. 1979. V. 59, N 3. Р. 527–605.

17.Соssins A., Sinnensky M. Adaptation to temperature, pressure and exogenous lipids // In: Physiologyn of membrane fluidity. – V. 2, Ed. M. Shinitxky, CRC Press, Boca Ration, 1984.

18.Еmirbekov E., Sershen H., Lajtha A. Lack of effects of hypothermia on cerebral amino acid uptake in vivo // Вrain Res. 1977. V. 125, N 7. Р. 187–191.

19.Lajtha A,. Sershen H. Change in the rates of protein synthesis in the brain of goldfish of various temperature // Life Sci. 1975. V. 17, № 10. Р. 1861–1868.]

20.Мinaire V., Vincent-Falguet J., Реrnod А., Сhаtоnnet J. Еnеrgу suрр1у in асute cold-exposed // J. Аррl. Рhуsiol. 1973. V. 36. Р. 51–57.

21.Redmann G., Brodwick М., Еаton D. Liposome-mediated lipid exchange effects on squid axon membrane currents // Вiophysic. J. 1979. v. 25. №2. P. 138.

Содержание

Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Глава 1. Азотистый обмен мозга при охлаждении животного . . . . 13

Глава 2. Влияние гипотермии на энергетический, белковый и липидный метаболизм в мозге . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.1.Влияние кратковременной и пролонгированной гипотермии на азотистый и углеводно-фосфорный метаболизм мозга

гомойотермных и гетеротермных животных . . . . . . . . . . 41

3.2.Азотистый метаболизм мозга сусликов в норме и при гипотермии

в постнатальном развитии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.3. Изменения концентрации мочевины в мозге сусликов различных возрастов в норме и при гипотермии . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.4.Анаэробный и аэробный гликолиз в ткани мозга сусликов

икрыс различного возраста при гипотермии . . . . . . . . . . 47

3.5.Динамика γ-аминомасляной, глутаминовой

иаспарагиновой кислот мозга при многократной гипотермии

ипоследующем самосогревании . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.6.Амидные группы белков головного мозга сусликов

при гипотермии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.7. Азотистый и углеводно-фосфорный обмен мозга теплокровного животного при гипотермии и зимней спячке . . . 56

3.8. Влияние гипотермии на динамику азотистых метаболитов мозга у адаптированных к холоду крыс . . . . . . . 59

3.9.Азотистый метаболизм головного мозга сусликов при гипотермии и совместном действии

гипотермии и гипероксии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62