Молекулярные процессы в мозге при принудительной гипотермии

Литература

1.Векслер Я. И., Гершенович З. С. Система аммиак – глутаминовая кислота –

глутамин мозга крыс при разных фазах гипотермии // Укр. биохим. журн. 1962. Т. 34. № 3.

2.Гаевская М. С. Биохимия мозга при умирании и оживлении организма. М., 1963.

3.Гершенович З. С., Эмирбеков Э. З. Азотистый метаболизм головного мозга сусликов при гипотермии и совместном действии гипотермии и гипероксии // Укр. биохим. журн. 1968. T. 40. № 3.

4.Силакова А. И., Труш Г. П., Явилякова Д. Микрометод определения аммиака

иглутамина в тканевых трихлоруксусных экстрактах // Вопр. мед. химии. 1962. T. 8. вып. 8.

5.Шугалей В. С., Готлобер И. В., Кричевская А. А., Гершенович З. С. Чувстви­­ тельность адаптированных к холоду и зимоспящих животных к действию повышенного давления кислорода // Теоретические проблемы действия низких температур на организм. Л., 1969.

6.Эмирбеков Э. З. Азотистый метаболизм при гипотермии и зимней спячке. Махачкала, 1969.

7.Эмирбеков Э. З., Гершенович А. З. Азотистый метаболизм мозга при гипотермии адаптированных к холоду крыс // Вопр. мед. химии 1966. вып. 4.

8.Dose K. Anwendung der Hochspannung sphoreographie bei der qi’antitativen totalanahse von proteinhydrolvsaten // Biochem. Journ. 1957. Vol. 329. № 4.

9.Seligson D., Seligson H. A microdiff usion method the determination of nitrogen liberated as ammonia // Journ. Lab. chim. Med. 1951. Vol. 32. P. 324.

3.9. Азотистый метаболизм головного мозга сусликов при гипотермии и совместном действии гипотермии

игипероксии

Изучение процессов освобождения и связывания аммиака в головном­ мозгу при экстремальных состояниях организма позволяет выяснить,­ в некоторой степени, специфическую роль этих процессов в деятельности нервной

системы.

Одним из таких состояний мы избрали искусственную гипотермию зимоспящего животного и комбинированное действие гипотермии и повышенного­ давления кислорода.

Опыты проводили в мае – июне на 60 сусликах (Citellus pygmaeus Pallas), отловленных на Кизлярскнх пастбищах (Дагестан).

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 63

Животных одинакового веса (200–250 г) охлаждали в холодовых одеялах до ректальной температуры 30, 20–19 и 11–10 °С. Температуру тела снижали до

11–10 °С постепенно, в течение 60–65 мин. За 15–20 мин до начала охлаждения сусли­ков фиксировали в специальном станке. Для контроля брали бодрствующих сусликов­. В одной из серий опытов охлажденных до 20–19 °С животных помещали на 30 мин в барокамеру, в которой с помощью медицинского кислорода создавали давление­ в 4 ат. Для дополнительного контроля бодрствующих сусликов подвергали 30-минутной гипероксии (4 ат.). По окончании экспозиции животному быстро отсекали голову, которая падала в сосуд с жидким воздухом. Мозг (большие полушария и отдельно­ мозжечок) извлекали в замороженном виде и в жидком воздухе растирали в порошок, который затем экстрагировали

втечение 20 мин 5 %-ной ТХУ на холоде; экстракт центрифугировали. В надосадочной жидкости определили свободный аммиак, глутамин; глутаминовую и γ-аминомасляную кислоты. Белковый осадок экстрагировали органическими растворителями и высушивали, чтобы освободить его от воды и липидов.

Высушенные навески ткани гидролизовали в 1-й. H2SO4 в течение 10 мин для определения лабильных амидных групп к 2 ч – для определения прочно связанных амидных групп. В гидролизате определяли освободившийся аммиак. Результаты статистически обработаны и приведены в таблицах в виде средних величин из десяти опытов.

Как видно из таблицы 14, концентрация глутамина, глутаминовой­ и γ-ами­ номасляной­ кислот в мозжечке контрольных животных­ намного меньше, чем

вбольших полушариях мозга.

Содержание аммиака в больших полушариях­ суслика при снижении температуры тела до 30 °С увеличивается почти­ в 7,1 раза, по сравнению с контролем. При охлаждении до температуры­ 20–19 °С содержание аммиака в больших полушариях снижается­ па 12,3 %, по сравнению с предыдущим этапом охлаждения.

Следует отметить, что, в отличие от крыс, у сусликов при температуре­ тела 20–19 °С не наблюдается состояния холодового наркоза. Холодовой наркоз у них наступает при температуре тела 11–10 °С. При этом содержание аммиака в больших полушариях мозга, по срав­нению с охлаждением до 20–19 °С, снижается на 26,3 %, но остается в 3,4 раза выше, чем в контроле. Следовательно, высокое содержание освободившегося при гипотермии аммиака в больших полушариях мозга­ сусликов с дальнейшим углублением гипотермии несколько

снижается­.

Искусственное снижение температуры тела суслика приводит к увеличению концентрации аммиака также и в мозжечке. Но закономерности­ изменения содержания аммиака в мозжечке и в больших полушариях­ различны. В мозжечке животных, охлажденных до 30 °С, содержится­ в три раза больше аммиака, чем в контроле. Снижение температуры­ до 20–19 °С еще больше

увеличивает его концентрацию. При холодовом наркозе (11–10 °С) содержание аммиака в мозжечке несколько ниже по сравнению с содержанием его при

охлаждении до 20–19 °С, но выше, чем в мозжечке сусликов с температурой тела 30 °С.

При охлаждении до 30 °С содержание глутамина в больших полушариях­ мозга сусликов остается на уровне контроля (табл. 14), а в мозжечке­ увеличивается на 26,7 %. При снижении температуры тела до 20–19 °С увеличивается содержание глутамина и в больших полушариях,­ и в мозжечке соответственно на 42,7 и 79,7 %. В состоянии холодового­ наркоза (температура тела 11–10 °С) содержание глутамина в больших полушариях мозга остается почти таким же, как и при охлаждении­ до 20–19 °С, а в мозжечке снижается на 26,8 %.

Таблица 14 Содержание аммиака, глутамина глутаминовой и γ-аминомасляной кислот

больших полушарий мозга и мозжечка суслика при гипотермии, гипероксии и совместном их действии, мг % (М±m)

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 65

Из табл. 14 видно, что динамика изменения содержания глутамино­ вой и γ-амино­масляной­ кислот в больших полушариях и в мозжечке также

различна.

Определение суммы амидных групп белков мозга на различных­ этапах охлаждения сусликов (табл. 15) показывает, что их содержание­ в больших полушариях и в мозжечке изменяется неодинаково. Но наблюдается перегруппировка лабильных и прочносвязанных амидных групп.

Вкоре больших полушарий при охлаждении тела сусликов до тем­пературы 30, 20–19 и 11–10 °С отношение­ лабильных амидных групп к прочносвязанным соответственно равняется 0,43; 0,37 и 0,33 (в контроле­ – 0,64), а в мозжечке 0,43, 0,41 и 0,39 (в контроле –0,56).

Таким образом, при искусствен­ном снижении температуры тела зимоспящего животного азотистый обмен в больших полушариях мозга и мозжечка изменяется по-разному. Общим для изучаемых отделов нервной системы является увеличе­ние содержания аммиака при сни­жении температуры тела.

Врезультате предыдущих экспериментов­ установлено, что при гипотермии адаптированных к холоду­ крыс содержание аммиака в мозге увеличивается на 85,6 % по сравнению­ с неадаптированными животными­ при такой же темпера­ туре тела. Многократная гипотермия­ (7–13 раз) увеличивает кон­центрацию аммиака в мозге крыс больше, чем однократное охлажде­ние, причем последующие охлаждения­ животные переносят легче­. Я. И. Векслером и З. С. Герше­новичем установлено, что в мозге крыс при охлаждении их до температуры­ 30 °С содержание аммиака­ составляет 2,11±0,39 мг %. В наших опытах при такой же температуре­ тела содержание аммиака в мозге суслика равно 3,445±0,270 мг %. Сопоставляя состояние зимоспящих и незимоспящих животных­ при гипотермии и содержание аммиака в мозге, можно сделать вывод, что освобождение аммиака в мозговой ткани имеет приспособительный­ характер при охлаждении животного.

Динамика азотистого обмена в мозге сусликов (табл. 14, 15) и крыс при 30-минутной гипероксии аналогична.

Нашими предыдущими опытами установлено, что взаимосвязи аммиакглутаминовой системы мозга крыс, устанавливающиеся при охлаждении до 20–19 °С, не изменяются при последующем действии кислорода под давлением

в4 ат.

Воздействие гипероксии (4 ат.) на охлажденных до 20–19 °С сусликов­ не сказывается на содержании аммиака, глутамина и глутами­новой кислоты в больших полушариях мозга (табл. 14); концентрация γ-аминомасляной кислоты при этом увеличивается на 51,1 %. В мозжечке­ количество глутамина снижается на 22,9, а γ-аминомасляной кислоты­ – на 47,8 %. При совместном действии

охлаждения до 20–19 °С и гипероксии содержание амидных групп в суммарных белках больших полушарий мозга сусликов остается таким же, как и при воз-

действии одного лишь охлаждения (табл. 15).

Полученные результаты свидетельствуют, что изменения азотистого­ обмена мозга, вызванные искусственным снижением температуры тела зимоспящего животного, устойчивы и лишь незначительно варьируют­ при воздействии кислорода под давлением 4 ат.

Таблица 15 Содержание амидных групп суммарных белков больших полушарий мозга

и мозжечка суслике при гипотермии, гипероксии и совместном их действии, в мкг на 1 мг сухого белка

При снижении температуры тела до 20–19 °С в мозге крыс и сусликов (табл. 14) устанавливается почти одинаковый уровень содержания­ аммиака (соответственно, 3,16±0,309 и 3,00±0,194 мг %). В то же время крысы находятся при этом в состоянии холодового наркоза,­ а суслики достаточно бодры. При гипотермии динамика азотистого обмена незимоспящих животных отличается от динамики этого про­

цесса у зимоспящих. Гипероксия не изменяет установленного уровня содержания аммиака в мозге охлажденных подопытных животных. По-видимому, это связано не с абсолютной концентрацией аммиака в ткани­ мозга, а с изменением тех или иных ферментативных систем, участвующих­ в его обмене.

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 67

3.10. ВЛИЯНИЕ ВСКАРМЛИВАНИЯ АМИНОКИСЛОТАМИ

ИГИПОТЕРМИИ НА СОДЕРЖАНИЕ СВОБОДНЫХ

ИСВЯЗАННЫХ ДИКАРБОНОВЫХ АМИНОКИСЛОТ В МОЗГУ КРЫС

Гипотермия как метод минимализации метаболизма широко используется в биологии и медицине, и при искусственном снижении температуры тела теплокровного животного в результате дискоординации­ ферментативных реакций развивается ряд патологических процессов в разных органах и тканях, и прежде всего, в головном мозгу. Нарушенный гипотермией метаболизм аминокислот мозга не восстанавливается в течение длительного (45–60 дн.) периода. Благодаря полифункциональным свойствам аминокислоты используются в качестве добавок к пище для улучшения функции мозга, в качестве протекторных веществ при действии экстремальных факторов. Для таких нейроактивных аминокислот, как глутаминовая (глу), аспарагиновая (асп)

игамма-аминомасляная (ГАМК), характерны свободные и связанные с белками мембранными структурами формы.

Для нормального функционирования мозга, очевидно, важен не только абсолютный уровень аминокислот,­ но и соотношение их свободных и связанных форм.

Внастоящей работе изучаются количественные изменения как свободной, так и связанной форм глу, асп и ГАМК в мозге при вскармливании крыс смесью этих аминокислот и при дальнейшей глубокой гипотермии.

Вопытах использовали лабораторных крыс-самцов массой 150–200 г, экспериментальных животных разделяли на 2 группы: одной группе ежедневно добавляли в пищу смесь аминокислот из расчета: глу – 3 мг, асп – 7 мг

иГАМК – 3 мг на 100 г живой массы, а вторая группа служила контролем. Вскармливание животных аминокислотами продолжалось 60 дн. по раз-

работанной нами методике. Крыс, получавших обычный рацион и вскормленных аминокислотами, подвергали гипотермии в специальных­ холодовых камерах с циркулирующей водой (4-5°C). Температуру тела снижали так, чтобы они достигала. Температуру тела снижали так, чтобы она достигала 20–10 °С за 55–60 мин. Сеансы гипотермии (20 °С) повторялись 3 paзa в течение 4 дней.

Для изучения постгипотермического состояния животных вынимали из камеры и оставляли в лаборатории до восстановления нормальной температуры. Крыс исследовали сразу после самосогревания через 7 сут. Интактных и экспериментальных крыс быстро обезглавливали, раскрывали черепную коробку и доставали большие полушария мозга. Очищенный от крови мозг опускали в холодный раствор Рингера и гомогенизировали с тефлоновым пестиком.

Гомогенат в соотношении ткань-раствор Рингера 1:5 центрифугировали,

внадосадочной жидкости определяли содержание свободных аминокислот,

восадке – связанных. Для определения связанных аминокислот к осадку добавляли 1 мл раствора Рингера, затем 3,5 мл 15 %-ной ТХУ и оставляли на 30 мин при 0–2 °С. Центрифугированную надосадочную жидкость отделяли, к осадку добавляли 2,5 мл раствора Рингера и после рассуспендирования центрифугировали.

Полученную надосадочную жидкость сливали с первой порцией, центрифугировали и вываривали осадок (растворяли в 1 мл дистиллированной воды).

Определяли количество аминокислот электpoфoрезом на бумаге по Дозе. В результате 2-месячного вскармливания крыс смесью 8 мг глу, 7 мг асп и 3 мг на 100 г живой массы ГАМК значительно изменился фонд этих аминокислот

вбольших полушариях мозга. При этом снизилось содержание свободной и связанной глу, в 3,3 и 3 раза, свободной асп в 1 раз, увеличилось­ содержание связанной ГАМК в 2 раза по сравнению с таковым у интактных крыс. Изменение соотношения свободных аминокислот в тканях мозга влияет на метаболизм индивидуальных аминокислот,­ прежде всего нейроактивных на их транспортные механизмы и активность энергетических субстратов.

Нами установлено, что вследствие изменения соотношения свободных глу, асп и ГАМК сдвигается равновесие, в результате что последние, видимо, подвергаются модуляции.

Если у гипотермированных контрольных крыс соотношение свободной и связанной глу, асп и ГАМК – 4,74, 5,64 и 2,14; то у животных, получивших вместе с пищей смесь аминокислот, оно составляет – 2,54, 2,88 и 6,2.

Влияние вскармиливания смесью глу, асп, ГАМК и гипотермии 20–19 °С на содержание их свободной и связанных форм в больших полушариях мозга крыс, мкмоль/г свежей ткани.

Мы изучили состояние глубокой гипотермической патологии, подвергнув крыс трехкратному сеансу охлаждения. По нашим данным, в мозге у этих животных самые низкие уровни содержания глу, асп и ГАМК, как свободной, так и связанной форм. Количество свободных и связанных исследуемых аминокислот

вмозге при трехкратной гипотермии у вскормленных аминокислотами крыс почти соответствует таковому у гипотермических контрольных животных, в нишу которых аминокислоты не добавлялись. Оказалось, что при самосогревании после перенесенной трехкратной гипотермии (20–19 °С) уронит, абсолютного

содержания свободной и связанной форм глу и асп в мозге как контрольных, так и вскормленных аминокислотами крыс одинаков. Однако через 7 сут. после перенесенной гипотермии содержание связанной формы всех исследуемых аминокислот в мозге значительно повышается по сравнению с таковым у контрольных.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что изменение содержания свободных асп, глу и ГАМК в мозге при гипотермии объясняется,

Глава 3. Выборочные экспериментальные работы по влиянию гипотермии на метаболизм мозга 69

прежде всего, модификацией различных путей их метаболизма: глутаминазы, глутаматдекарбоксилазы, аминотрансферазы, активности энергетического

обмена. Видимо, в условиях гипотермии уровни содержания отдельных нейромедиаторных аминокислот­ балансируются и дополнительным выбросом из мест их связывания. Наиболее вероятно, что причиной изменения содержания связанных аминокислот в мозге является модификация субцеллюлярных частиц белков, мембранных структур. Результаты нашей работы вызывают интерес к некоторым сведениям, таким, как блокирование гипотермией 25 °С с синаптической передачи, обнаружение в мозге крыс чувствительных к холоду синаптосом, аккумулирование в синаптосомах мозга нейротрансмиттеров

вусловиях холода, зависимость ассоциации биологически активных веществ

всинаптосомах гипоталамуса от температуры и т.д.

Таким образом, анализ наших собственных и литературных данных показал, что глу, асп и ГАМК при гипотермии активизируют свою модуляторную роль в мозге и можно предположить наличие в тканях мозга температурной регуляции модуляторной функции этих аминокислот. Можно рекомендовать применение глу, асп и ГАМК и качестве протекторных веществ при гипотермии.

3.11. ИНТЕНСИВНОСТЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ ПРИ ГИПОТЕРМИИ НА ФОНЕ ВВЕДЕНИЯ ДАЛАРГИНА

Активные формы кислорода (АФК), помимо сти­муляции перекисного окисления липидв (ПОЛ), способствуют окислительной модификации­ как растворимых, так и мембранносвязанных­ белков, что приводит к потере их функциональной активности. Начальные этапы­ гипотермии стимулируют образование АФК; это подтверждает данные об интенсивности процессов­ ПОЛ крови и различных тканей. Вместе с тем неизвестно, как гипотермия влияет­ на степень окислительной модификации белков­. Ранее показано, что предварительное внутрибрюшинное­ введение синтетического аналога лейэнкефалина даларгина предотвращает активацию­ процессов ПОЛ тканей при различных стрессорных состояниях, в том числе при ги­потермии. Можно ожидать, что защитный антиоксидантный эффект даларгин окажет и в отношении белков.

В настоящей работе исследована зависимость интенсивности реакций свободнорадикального окисления белков плазмы крови от глубины гипотермии­ и выяснена возможность коррекции этих процессов путем введения опиоидного пептида­ даларгина.

Опыты проводили на белых беспородных крысах­-самцах массой 170–200 г. Гипотермию вызывали,­ помещая животное в холодовую камеру до снижения