Общая микробиология. Лабораторный практикум

давленной капли». Неподвижную культуру из пробирки с фенолом отсеять в пробирку со свежим питательным бульоном, испытать на подвижность методом «раздавленной капли». Сделать вывод.

5.Ознакомиться с диссоциацией бактерий S- и R-формы.

6.Поставить опыт трансформации: поместить в пробирку 1 мл раствора ДНК – культуры донора и 1 мл культуры-реципиента, смесь ин-

кубировать в течение 30 мин при температуре 37 °С, после чего произвести высев петлёй на селективную питательную среду, содержащую 100 ед/мл стрептомицина. Одновременно произвести контрольные высевы культуры-реципиента и раствора ДНК. При учёте результатов обратить внимание на наличие роста в высеве из трансформационной смеси при отсутствии роста в контрольных высевах.

7. Поставить опыт трансдукции: в пробирку поместить 1 мл 4-часовой культуры-реципиента E. coli lac–, добавить 1 мл суспензии трансдуцирующего фага, содержащего 1 мл 106–107 частиц, смесь инкубировать в течение 60 мин при температуре 37 °С, после чего 0,1 мл смеси нанести на среду Эндо и распределить стеклянным шпателем по поверхности чашки. Контролем служит посев 0,1 мл культуры-реципиента на ту же среду. Чашки инкубировать в термостате. При учёте результатов следует определить число выросших колоний, способных расщеплять лактозу (окрашенных в красный цвет).

Контрольные вопросы

1.Какое значение имеет изучение генетики микроорганизмов?

2.Какова организация генетического материала у бактерий? Что такое генотип, фенотип и генофонд популяций бактерий?

3.Что представляют собой внехромосомные факторы наследственности микроорганизмов?

4.Чем характеризуются фенотипические изменения (модификации) бактерий?

5.В чем состоят генотипические изменения у микроорганизмов?

6.Что собой представляют мутации, каков их молекулярный меха-

низм?

7.Какие типы мутаций встречаются у бактерий?

8.Что такое мутагены и каков механизм их действия?

9.Какие формы генетических рекомбинаций присущи бактериям?

51

РАЗДЕЛ IV ИНФЕКЦИЯ

ТЕМА 4.1. Биологический метод исследования, формы инфекции

Инфекция – совокупность патологических, адаптационно – приспособительных и репаративных реакций организма, возникающих

врезультате его конкретного взаимодействия с патогенными и при определенных условиях условно-патогенными вирусами, бактериями и грибами. Аналогичные процессы, вызванные простейшими, называ-

ют инвазиями.

Биологический (экспериментальный) метод исследования состоит

вискусственном воспроизведении клинической картины инфекционных болезней на лабораторных животных. В практической микробиологии его используют для диагностики инфекционных болезней, выде-

вэкспериментальной микробиологии и иммунологии, а также для контроля иммунопрепаратов.

Биологический метод исследования используют в тех случаях, если другие методы неэффективны и если имеются необходимые условия для содержания лабораторных животных. Метод включает заражение животного, наблюдение за ним, вскрытие погибшего или забитого животного.

Материал для заражения должен быть забран в асептических условиях, в стерильную посуду, гомогенизирован, использован возможно быстрее. Способ заражения зависит от типа материала, вида животного, предполагаемого повреждающего агента. Материал может быть введён накожно, подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, через нос, рот и прямую кишку, в сердце, желудок, мозг,

ввагину, яичко, конъюнктиву, в суставные полости. Перед заражением с операционного поля необходимо удалить шерсть и обработать его 70 % этанолом с последующим смазыванием настойкой йода.

При наблюдении за зараженными животными отмечается вялость, отсутствие аппетита, понос, различные двигательные нарушения. В этот период животные должны быть обеспечены полноценным питанием, доброкачественной питьевой водой, предохранены от простуды, перезаражения.

Вслучае гибели животного или его умерщвления проводят микробиологическое исследование трупа. Вскрытие производят в асептических условиях: мелких животных – в кюветах на парафиновой пла-

52

стинке, крупных – на специальных операционных столиках. Целью бактериологического исследования трупа является обнаружение микроба, содержавшегося во введенном материале, определение места его локализации в организме и выделение чистой культуры возбудителя.

Формы инфекции, в зависимости от свойств главных факторов инфекционного процесса (т. е. возбудителя и макроорганизма), принято разделять на две основные группы:

1) манифестная инфекция, которая протекает при наличии характерного симптомокомплекса, включает:

•типичную для данного возбудителя форму инфекции, когда возбудитель проникает в организм, активно в нём размножается, вызывая типичные для данной болезни клинические проявления;

•атипичную форму, когда возбудитель проникает в организм, активно в нём размножается, организм отвечает соответствующими иммунно-биологическими реакциями, которые приводят к формированию активного иммунитета, но клинические симптомы болезни носят невыраженный, стёртый или атипичный характер;

•персистентную (хроническую) форму, когда возбудитель проникает в организм, размножается в нём, вызывает активную форму болезни, но под влиянием иммунных систем организма и химиопрепаратов подвергается L-трансформации. L-формы бактерий могут длительное время персистировать в организме. Возвращаясь в свою исходную форму, возбудитель вызывает рецидив болезни (например, туберкулёз);

•медленные инфекции, когда возбудитель проникает в организм

иможет долгое время сохраняться в нём внутриклеточно в латентном состоянии. При благоприятных для возбудителя условиях он начинает размножаться, заболевание протекает всё тяжелее и тяжелее и, как правило, заканчивается смертью больного (например, от СПИДа);

2) бессимптомная инфекция, которая протекает без выраженных симптомов, включает:

•абортивную форму инфекции, когда возбудитель проникает в организм, но не размножается в нём. Инфекционный процесс обрывается,

ивозбудитель рано или поздно погибает или удаляется из организма;

•латентную форму, когда возбудитель проникает в организм, размножается в нём, макроорганизм отвечает на него соответствующими иммунобиологическими реакциями, ведущими к формированию приобретенного иммунитета и удалению возбудителя из организма. Однако никаких внешних клинических проявлений этой инфекции нет, она протекает скрыто (например, полиомиелит, бруцеллёз, некоторые вирусные гепатиты);

•дремлющую инфекцию, когда бессимптомное пребывание возбудителя в организме может сохраняться долгое время после латентной инфекции или после перенесенного заболевания. Патогенные микробы

53

находятся некоторое время как бы в «дремлющем» состоянии. Под влиянием условий, понижающих сопротивляемость организма, микроорганизмы активизируются и вызывают заболевание или его рецидив (например, заглохший воспалительный процесс в кариозном зубе);

•бактерионосительство, когда после либо латентной инфекции, либо перенесенного заболевания организм в состоянии полностью освободиться от возбудителя. Бактерионосители, являясь источником заражения, играют большую роль в эпидемиологии многих заболеваний (например, брюшного тифа, дифтерии).

Задания

1.Заразить белых мышей исследуемым материалом подкожно и внутрибрюшинно, проведя предварительное обезболивание. Для чего животное поместить до засыпания в закрытый стеклянный сосуд, в котором находится вата, смоченная эфиром или хлороформом.

Подкожный способ заражения

При подкожном введении исследуемого материала фиксировать животное, протереть место инъекции кусочком ваты, смоченной в спирте, захватить в складку кожу на спине у корня хвоста, ввести в неё иглу примерно до половины, медленно ввести 0,5 мл материала, отпустить складку. Затем иглу быстро извлечь, прикрыв место инъекции ватой, смоченной спиртом.

Внутрибрюшинный способ заражения

Животное фиксировать головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. После обработки спиртом места инъекции в левой нижней трети живота проколоть кожу, держа иглу под острым углом, затем перевести шприц в положение, перпендикулярное брюшной стенке, толчкообразным движением проколоть брюшину и ввести содержимое шприца. Извлечь иглу, прикрыв место инъекции ватой, смоченной в спирте.

2.Произвести вскрытие погибших белых мышей. Вскрытие и исследование трупа животного делят на 3 этапа.

Вскрытие и исследование наружных покровов

Закрепить труп животного животом кверху, положив его на кусочек марли, смоченной дезинфицирующим раствором. Обработать шерсть и кожу ватным тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором. Стерильными инструментами сделать разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы вдоль конечностей. Отсепарировать кожу, отметить состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов. При обнаружении измененных узлов произвести из них посевы на питательные среды и сделать мазки – отпечатки на предметных стёклах.

Вскрытие и исследование грудной полости

54

Вскрыть грудную полость, для чего сделать разрез в диафрагме, ввести в него браншу ножниц, перерезать рёбра с обеих сторон от грудины, откинуть вырезанный лоскут кверху, осмотреть органы грудной полости. При наличии экссудата сделать из него посевы и мазки. Для взятия крови из сердца прижечь пинцетом участок его, проколоть этот участок стерильной пастеровской пипеткой, набрать несколько капель крови, произвести посев и приготовить мазок. Сделать посев из ткани лёгкого и мазки – отпечатки из него;

Вскрытие и исследование брюшной полости

Вскрыть брюшную полость, осмотреть её органы, обратить внимание на наличие экссудата, величину и цвет печени, селезёнки, мезентериальных лимфатических узлов. Произвести посевы из печени, селезёнки, почек, лимфоузлов и приготовить мазки – отпечатки этих органов. Для этого вырезать из ткани органа небольшие кусочки, взять пинцетом и прикоснуться к поверхности агара в соответствующем участке чашки Петри (рис. 4.1), а затем к предметному стеклу. По окончании вскрытия завернуть труп в подложенную под него марлю.

Кровь

Лёгкие Печень

Селезёнка Почки

Пах. уз. Мезен. уз.

Рис. 4.1. Схема посева из органов белой мыши

3.Зафиксировать приготовленные мазки – отпечатки над пламенем, окрасить водным фуксином или метиленовым синим, а также по Граму, микроскопировать.

4.Зарегистрировать результаты определения ферментов агрессии (коагулазы, фибринолизина), гемолитической способности бактерий.

Определение клеточной коагулазы

В капле густой суспензии исследуемой культуры на предметном стекле размешать каплю цельной цитратной плазмы кролика или человека. В положительных случаях через несколько секунд образуется сгусток. Одновременно поставить заведомо положительный и заведомо отрицательный контроль.

Пробирочная реакция установления свободной коагулазы

55

В 1 мл цитратной плазмы кролика или человека, цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором, размешать по петле 18–24-часовой агаровой культуры. Смесь вместе с заведомо положительным и заведомо отрицательным контролями инкубировать при 37 °С и контролировать на появление сгустка через 2–4–18 ч. Дальнейшая инкубация свёрнутой плазмы может привести к расплавлению сгустка, что свидетельствует о фибринолитической активности исследуемой культуры.

Определение гемолитической активности

Приготовить кровяной агар, для чего к расплавленному и охлажденному до 45 °С 2 %-ному МПА добавить 5–10 % подогретой стерильной крови барана, кролика или человека, смешать и разлить по чашкам Петри, выдержать сутки в термостате на возможно бактериальную контанацию. Исследуемую культуру засеять штрихом или бляшкой. Гемолиз проявляется в виде зон просветления вокруг колоний или бляшек роста.

Контрольные вопросы

1.Чем характеризуется инфекция?

2.Какие периоды болезни выделяют при манифестной инфекции?

3.Дайте характеристику признакам микроорганизма, определяющим развитие инфекции.

4.Какими факторами определяется вирулентность микробов?

5.Что представляют собой ферменты агрессии?

6.Каков химический состав и механизм действия бактериальных токсинов?

7.В чём состоят различия между бактериальными экзо – и эндотоксинами?

8.Чем определяются инфекционные свойства вирусов и каковы особенности вирусных инфекций?

9.Каковы пути распространения микробов в организме?

10.В чём различие между бактериемией и септицемией?

11.В чём состоит биологический (экспериментальный) метод исследования?

12.Каковы методы экспериментального заражения животных?

13.Каков порядок вскрытия лабораторных животных?

14.Какими методами определяют наличие ферментов агрессии и гемолитической способности бактерий?

15.Какие формы манифестной инфекции вам известны?

16.Какие формы бессимптомной инфекции вам известны?

56

РАЗДЕЛ V САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ТЕМА 5.1. Санитарно-микробиологическое исследование оборудования, рук и спецодежды персонала

Бактериальное загрязнение определяют путём изучения микрофлоры смывов, сделанных с рук и поверхностей исследуемых объектов.

В зависимости от целей исследования в смывах определяют:

1 – общую бактериальную обсеменённость с пересчётом на 1 см2 исследуемой площади;

2 – наличие бактерий группы кишечной палочки (БГКП); 3 – наличие золотистого стафилококка, синегнойной палочки и дру-

гих патогенных микробов.

Требование к микробиологической чистоте: не допускается присутствие БГКП, золотистого стафилококка, синегнойной палочки, протея в смывах.

Задание

Отбор проб

С рабочих столов, оборудования, рук и спецодежды персонала пробы отбирают методом смыва стерильным ватным тампоном.

Взятие смывов производят стерильным ватным тампоном или марлевыми салфетками, размером 5х5 см, простерилизованными в бумажных пакетах или в чашках Петри. Для увлажнения тампонов и салфеток

встерильные пробирки наливают по 2 мл стерильного физиологического раствора. Салфетку захватывают стерильным пинцетом, увлажняют физиологическим раствором из пробирки, после протирания исследуемого объекта помещают в ту же пробирку.

При контроле мелких предметов смывы забирают с поверхности всего предмета. При контроле предметов с большой поверхностью

смывы проводят в нескольких местах исследуемого предмета площадью примерно в 100–200 см2.

Смывы с кожи операционного поля и рук хирургов производят стерильными марлевыми салфетками размером 5х5 см, смоченными

врастворе нейтрализатора или в физиологическом растворе. Руки обследуемого протирают, начиная с тыльной части ладони, далее ладонь, межпальцевые поверхности, ногтевые ложа и подногтевые поверхности.

57

Определение общего микробного числа в исследуемом смыве

К 2 мл изотонического раствора хлорида натрия, используемого для увлажнения тампона (или салфетки), прибавляют ещё 8 мл и тампон отмывают встряхиванием со стеклянными бусами в течение 10 мин. Отмывную жидкость (1:10) засевают глубинным способом по 0,5 мл на 2 чашки Петри с МПА. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч. Затем подсчитывают количество выросших колоний, делая перерасчёт на 1 см2 исследуемой поверхности.

Определение БГКП

Производят посев в среду обогащения, для чего тампон (марлевую салфетку) погружают в среду Кесслера или 10–20 % желчный бульон. Через сутки инкубирования при 37 °С делают пересев на среду Эндо. После инкубации в термостате при 37 °С в течение 18–24 ч, подозрительные колонии микроскопируют, пересевают в среду Гисса с глюкозой и выдерживают при 43 °С 24 ч. Затем производят учёт результатов.

Обнаружение стафилококков

Делают посев непосредственно с тампона на желточно-солевой агар. Кроме того, в качестве среды наполнения используют бульон с 6,5 % хлорида натрия и бульон с 1 % глюкозы, разлитые по 0,5 мл в пробирки, куда засевают по 0,2–0,3 мл смывной жидкости. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч, а затем делают пересев на чашки с желточно-солевым агаром. Дальнейшее исследование проводится по общепринятой методике обнаружения стафилококков.

Выявление синегнойной палочки

Специальные посевы можно не производить. Обычно колонии синегнойной палочки удаётся выявить на кровяном агаре или на среде Эндо. Колонии, подозрительные на синегнойную палочку, пересевают на скошенный агар, содержащий 2–5 % глицерина или маннита. Колонии синегнойной палочки дают на поверхности скошенного агара обильный рост с зеленоватым оттенком, маслянистой консистенции с характерным медовым запахом. Выделенную культуру окрашивают по Граму, микроскопируют, определяют гемолитические свойства путём высева на чашку с кровяным агаром.

58

Контрольные вопросы

1.Как определяют бактериальное загрязнение?

2.Какие требования предъявляются к микробиологической чистоте?

3.В чём состоит метод смыва стерильным ватным тампоном?

4.Как определяют ОМЧ в исследуемом смыве?

5.Метод определения БГКП?

6.На какой среде и каким методом проводят обнаружение стафилококка?

7.На каких средах и как выявляют синегнойную палочку?

ТЕМА 5.2. Исследование на носительство золотистого стафилококка

Для выявления носителей золотистого стафилококка медицинский персонал ЛПУ, а также родильных домов, детских больниц, детских поликлиник, отделений патологии новорожденных, недоношенных обследуют при поступлении на работу и в дальнейшем – 1 раз в 6 мес.

Задания

Забор материала

Забор материала из передних отделов носа осуществляют одним стерильным ватным тампоном из обеих половин носа. Сбор материала из зева проводят с поверхности миндалин стерильным ватным тампоном, либо путём смыва. В последнем случае обследуемый полощет горло 5,0 мл стерильного физиологического раствора. Смыв собирают в стерильную колбу (желательно с бусами), закрывают пробкой и встряхивают в течение 10–15 мин до получения однородной суспензии. При этом обязательным условием является взятие материала натощак (не ранее, чем через 2–3 ч после приёма пищи). Посев исследуемого материала на питательные среды должен проводиться не позже, чем через 2 ч после его забора.

Посев исследуемого материала на питательные среды

Посев на желточно-солевой агар проводят тампоном, которым забирали материал. Тампон следует многократно поворачивать, чтобы перенести на питательную среду максимальное количество взятого материала. В другом варианте: взятый тампоном материал помещают в пробирку с 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Тампон

59

ополаскивают в жидкости встряхиванием пробирки в течение 10 мин, затем отжимают о внутренние стенки пробирки и удаляют. Жидкость многократно перемешивают пипеткой. Отдельной пипеткой на чашку с желточно-солевым агаром наносят 0,1 мл исследуемого смыва и тщательно растирают шпателем.

При посеве смыва из зева на питательную среду наносят 0,1 мл жидкости и тщательно растирают по поверхности среды шпателем.

Чашки инкубируют 2 суток при температуре 37 °С, после чего подсчитывают общее число выросших колоний и отдельно колоний различной морфологии. Особое внимание обращают на колонии, обладающие лецитиназной активностью. Делают пересчёт на объём жидкости, используемой для смыва, или на один тампон.

Подсчёт обсеменённости

Массивность обсеменения, выражающаяся показателем 102 микробных клеток, снимаемых на тампон, является показателем умеренной обсеменённости верхних дыхательных путей. При таком обсеменении выделение возбудителя во внешнюю среду, как правило, не имеет места. Если показатель 103 и более микробных клеток, снимаемых на тампон, то обсеменённость высокая. При таком обсеменении происходит выделение возбудителя во внешнюю среду как при различных экспираторных актах, так и при спокойном дыхании. Повторное выделение микроорганизмов в высокой концентрации (103 КОЕ и более) свидетельствует о микробоносительстве. Для санации микробоносители проходят специальные процедуры с применением антимикробных воздействий.

Контрольные вопросы

1.Каковы физиологические особенности золотистого стафилококка?

2.В каких случаях проводят выявление носителей золотистого стафилококка среди медицинского персонала ЛПУ?

3.Как проводят забор материала для выявления носительства золотистого стафилококка?

4.Какую среду используют для посева исследуемого материала?

5.Какие техники посева используют при посеве взятого исследуемого материала?

6.Какими методами проводится подсчёт обсеменённости материала?

7.Какая обсеменённость считается высокой?

8.Какие препараты используются для санации микробоносителей?

60