Общая микробиология. Лабораторный практикум

3. Окраска жгутиков по методу Леффлера.

а) приготовить мазок из 18–24-часовой культуры, для чего взвесь бактерий внести в каплю стерильной водопроводной воды, нанесенной на предметное стекло, и высушить;

б) мазок обработать в течение 15–20 мин протравой, содержащей 1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 25 %-ного водного раствора танина и 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа;

в) мазок тщательно промыть водой, высушить на воздухе и докрасить фуксином Циля в течение 3–4 мин при легком подогревании;

г) препарат промыть водой и высушить; д) приготовить мазок из спороносной культуры способом Ожешки,

окрасить по Цилю – Нильсену и микроскопировать.

4. Выявление спор способом Ожешки.

а) приготовить мазок на краю предметного стекла; б) нефиксированный мазок подвергнуть протравливанию кислотой

при повышенной температуре, для чего на мазок налить 1 %-ный раствор соляной кислоты и подогреть над пламенем горелки в течение 2– 3 мин; в) кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксиро-

вать над пламенем.

При такой обработке оболочка споры размягчается и становится доступной для красителя. Далее мазок окрасить по методу Циля – Нильсена:

а) на мазок поместить кусочек фильтровальной бумаги, на него налить карболовый фуксин Циля и подогреть стекло над пламенем горелки до появления паров;

б) охладить, снять бумагу, промыть водой и обесцветить 5 %-ной серной кислотой в течение 30 сек;

в) препарат тщательно промыть водой и докрасить раствором метиленового синего в течение 3–5 мин;

г) препарат промыть водой и высушить.

Карболовая кислота разрыхляет оболочку споры и тем самым повышает её тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия бактериальных спор с красителями. Споры окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой вегетативные тела бактерий обесцвечиваются метиленовым синим.

Контрольные вопросы

1.Какова роль капсулы в жизнедеятельности бактериальной клетки?

2.Каков химический состав капсул и микрокапсул?

21

3.Какими методами выявляется капсула бактерий?

4.Каковы основные функции включений?

5.Как обнаружить наличие зёрен волютина у бактерий?

6.Какова структура, химический состав и функции жгутиков бактериальной клетки?

7.Каков принцип выявления жгутиков?

8.Каковы особенности строения пилей, фимбрий?

9.Какую роль играют споры бактерий?

10.Каковы особенности структуры и химического состава бактериальных спор?

11.В чём состоит процесс спорообразования у бактерий?

12.Какими методами выявляются споры бактерий?

ТЕМА 1.5. Микроскопический метод исследования: морфология клеточных форм микроорганизмов

Среди основных форм микроорганизмов выделяют следующие группы: бактерии, грибы, вирусы, простейшие. Особой группой являются микоплазмы.

Грибы – микроорганизмы, характеризующиеся следующими основными признаками: в протоплазме располагаются несколько ядер с двойной мембраной, ядрышком и хромосомами, а также рибосомы, митохондрии, лизосомы, вакуоли, включения гликогена, волютина, развитая эндоплазматическая сеть. Клеточная стенка толстая, прочная, содержит хитин, хитинозан, целлюлозу. С возрастом клеточная стенка утолщается, иногда в ней откладываются высокомолекулярные липиды, минеральные соли, пигменты. Тело мицеллярных грибов представляет собой систему из ветвящихся, разделенных или неразделенных перегородками нитей – гиф, которые образуют мицелий. У дрожжевых и дрожжеподобных грибов форма тела палочковидная, овальная или шаровидная. Размеры мицелярных грибов 1–10 х 100 мкм, дрожжей

1,5–6 х 1,5–8 мкм.

Способы размножения многообразны:

1 – вегетативный способ, при котором мицелий распадается на фрагменты с образованием артроили хламидоспор;

2 – бесполое размножение состоит в образовании эндоили экзоспор на специальных изолированных гифах – спорангиях;

22

3 – половые способы проявляются в слиянии двух гаплоидных ядер или фрагментов мицелия с последующим редуцированным делением гаметы (мейоз). Различают низшие (хитридиомицеты, гифохитридиомицеты, оомицеты, зигомицеты) и высшие (аскомицеты, базидиомицеты, дейтеромицеты) грибы. Для изучения морфологии грибов применяется микроскопия нативных препаратов, приготовленных по типу препарата «раздавленная капля».

Простейшие – одноклеточные животные организмы, имеющие формы шара, овоида, боба, рыбы. Размеры колеблются от 1–2 до сотни и более мкм. Простейшие имеют одно, реже два и более ядер, в ядре выявляется до 6 хромосом. Кариоплазма хорошо выражена. В центре располагается ядрышко. Цитоплазма нередко разделяется на эктоплазму, имеющую гелеобразную консистенцию, и жидкую эндоплазму. В эндоплазме присутствуют митохондрии, эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи, рибосомы, иногда вакуоли, включения гликогена. Оболочка типа пелликулы или кутикулы. Некоторые виды могут превращаться в форму покоя – цисту. Для изучения простейших прибегают к исследованию нативных препаратов, а также окрашенных по Романовскому – Гимза после фиксации смесью Никифорова, этиловым или метиловым спиртом. Для выявления простейших в крови готовят препараты «толстая петля», которые окрашивают по Романовскому– Гимза.

Микоплазмы – уникальная группа мелких грамотрицательных бактерий, отличающихся полным отсутствием клеточной стенки. Это полиморфные сферические, эллипсоидные (размерами 0,2 – 1,5 мкм) и нитевидные ветвящиеся клетки (длиной до 150 мкм). Благодаря малым размерам микоплазмы могут фильтроваться через бактериальные фильтры. Не образуют спор, обычно неподвижны. Название подчёркивает их пластичность и то, что они имеют гомогенную консистенцию.

В отдельные группы выделены микроорганизмы переходных форм. Актиномицеты (actis – луч, myces – гриб) – бактерии, по внешнему виду сходные с мицеллярными грибами. Мицелий большинства актиномицетов имеет форму тонких (0,2–2 мкм) ветвящихся, разделенных или неразделенных перегородками нитей – гиф. Кроме мицеллярной, встречаются палочковидная и кокковидная формы. От грибов отличаются строением ядра (нуклеоид), клеточной стенки (содержат пептидогликаны и не содержат хитин и целлюлозу), чувствительностью к антибактериальным препаратам. Бывают подвижные и неподвижные виды. Капсул не образуют. Грамположительные и грамотрицательные. Раз-

23

множаются с помощью спор, которые формируются в результате сегментации и фрагментации гиф. Описан половой способ размножения. Для изучения актиномицетов готовят окрашенные препараты или препарат «раздавленная капля».

Спирохеты (spira – виток, chaite – волосы) – тонкие спирально извитые подвижные микроорганизмы, которые обладают признаками бактерий (отсутствие дифференцированного ядра, способ размножения) и простейших (осевая нить, активно сокращающееся тело). Размеры клеток 0,05–3 х 5–500 мкм. Нить растянута на всю длину клетки, выполняет локомоторную и опорную функции, содержит пучок в 2–150 фибрилл белка флагеллина и аминосахара. В неблагоприятных условиях спирохеты могут переходить в цисту, представляющую собой укороченную и свёрнутую в спираль, окруженную толстой слизистой оболочкой спирохету. Грамотрицательные, но в процессе окраски по этому методу тело спирохет часто разрушается. Для их выявления исследуют нативные препараты при помощи темнопольной или фазово-контрастной микроскопии, а также препараты, окрашенные по Романовскому – Гимза или методом серебрения по Морозову.

Группа бактерий, которые аналогично вирусам являются облигатными внутриклеточными паразитами, включает риккетсий и хламидий.

Риккетсии – мелкие (0,3–0,6 х 0,4–2 мкм) полиморфные грамотрицательные бактерии, названные в честь американского микробиолога Г. Риккетса. жизненный цикл риккетсий зависит от жизнедеятельности клетки хозяина и складывается из 2 стадий – вегетативной и покоящейся. В вегетативной стадии они имеют палочковидную форму, активно размножаются путем бинарного деления и обладают активной подвижностью. В покоящейся стадии имеют сферическую форму и не размножаются. Риккетсии – типичные прокариоты. Для их выявления применяется окраска препарата по Романовскому – Гимза.

Хламидии – мелкие аспорогенные бескапсульные грамотрицательные неподвижные бактерии. Вне клеток хозяина хламидии существуют

ввиде элементарных телец сферической формы размерами 0,3 мкм. В клетке хозяина они превращаются в ретикулярные тельца (диаметром 1 мкм), которые начинают делиться. Особи конечного деления превращаются в элементарные тельца, располагающиеся в цитоплазме

ввиде микроколоний, окруженных общей мембраной (хламидой). По Романовскому – Гимза элементарные тельца окрашиваются в красный цвет, ретикулярные – в голубой.

24

Задания

1.Приготовить препараты «раздавленная капля» из грибов и актиномицетов, для чего в каплю воды на предметном стекле внести кусочек мицелий или тела гриба, тщательно расщепить его и накрыть покровным стеклом. Микроскопировать с сухой системой. Обратить внимание на строение мицелия, органов плодоношения.

2.Приготовить фиксированные препараты дрожжевых грибов, окрасить фуксином или метиленовым синим, микроскопировать. Обратить внимание на форму клеток, наличие признаков почкования.

3.Изучить морфологию простейших в готовых окрашенных препаратах. Приготовить препарат «толстой капли» из крови.

Приготовление препарата «толстая капля»

На предметное стекло нанести две капли крови, которые равномерно распределить в виде пятна диаметром 1–1,5 см. Нефиксированный препарат окрасить по Романовскому – Гимза.

Окраска по Романовскому – Гимза

Краска Романовского – Гимза состоит из азура, эозина и метиленового синего. Цитоплазма окрашивается в голубой цвет, ядро – в краснофиолетовый. Перед окраской 20 капель краски добавить к 10 мл дистиллированной воды и налить её на препарат на 30–40 мин, после чего краску слить, препарат промыть водой, высушить и микроскопировать.

4.Ознакомиться с морфологией спирохет в окрашенных по Романовскому – Гимза препаратах и в нативных препаратах при темнопольной микроскопии.

Техника темнопольной микроскопии

С помощью осветителя и его диафрагмы равномерно освещают зеркало микроскопа и вращением добиваются появления на верхней линзе конденсора освещенного кольца. На поверхность конденсора наносят каплю дистиллированной воды, препарат «раздавленная капля» кладут на столик микроскопа и конденсор поднимают до соприкосновения с предметным стеклом. Устанавливают большой сухой объектив, находят объект, с помощью зеркала достигают максимальной освещенности поля зрения, после чего добиваются резкости изображения. На тёмном фоне видны спирохеты в виде тонких, блестящих, спиралевидно закрученных нитей.

5.Изучить морфологию риккетсий, хламидий, микоплазм в готовых препаратах.

25

Контрольные вопросы

1.Каковы основные различия в ультраструктуре клеток прокариотических и эукариотических микроорганизмов?

2.Чем характеризуются микоплазмы?

3.Как устроены клетки микроскопических грибов?

4.Какими способами размножаются грибы?

5.Чем отличаются низшие грибы от высших?

6.Каковы морфологические особенности простейших?

7.Какие микроорганизмы относят к переходным формам и чем они характеризуются?

8.Каковы особенности строения актиномицетов?

9.Какое строение имеют спирохеты?

10.Каковы отличительные особенности риккетсий и хламидий?

11.Какими методами изучаются грибы и актиномицеты?

12.Какие методы исследования применяют для выявления спирохет и простейших?

26

РАЗДЕЛ II ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

ТЕМА 2.1. Бактериологический метод. Культивирование микроорганизмов: питательные среды и методы стерилизации. Выделение чистых культур

Культивирование микроорганизмов широко используется в лабораторных условиях для их выделения, накопления и сохранения. Для культивирования бактерий пользуются естественными и искусственными питательными средами различного состава. Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

•содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества, соли и ростовые факторы;

•иметь оптимальную рН вязкость, достаточную влажность;

•должны быть стерильными и по возможности прозрачными.

По назначению питательные среды подразделяют на следующие основные категории:

•основные – предназначены для выращивания многих видов бактерий (мясо – пептонный бульон, мясо – пептонный агар);

•элективные – способствующие развитию отдельных видов микробов (кровяные, сывороточные, яичные);

•селективные – подавляющие рост одних микроорганизмов и не влияющие на рост других (среды Мюллера, селенитовая, Рапопорт);

•дифференциально-диагностические – позволяющие отличать од-

ни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гиса).

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, плотными и полужидкими. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких-либо веществ, чаще всего мясной воды, различных гидролизатов, иногда естественных продуктов (молока, крови). Для получения плотных сред к ним добавляют агар – агар, который представляет собой полисахарид сложного состава, получаемый из морских водорос-

лей. Агар – агар плавится при 100 °С, но при охлаждении сохраняет жидкую консистенцию до 45 °С. Для получения плотных сред его добавляют в концентрации 1,5–3,0 %. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агара (0,3–0,7 %).

27

Стерилизация – обеззараживание, полное уничтожение микроорганизмов в питательных средах, посуде и прочих различных материалах. Производится с помощью физических, химических и механических методов.

К физическим относятся:

а) прокаливание, или фламбирование над пламенем горелки; б) кипячение; в) стерилизация сухим жаром; г) стерилизация паром под давлением – автоклавирование; д) стерилизация текучим паром; е) дробная стерилизация; ж) тиндализация; з) пастеризация; и) стерилизация УФ-лучами; к) стерилизация ионизирующим излучением (рентгеновские или гамма-лучи).

Химическая стерилизация проводится с помощью веществ, обладающих антимикробным действием. В качестве стерилизантов в настоящее время используют растворы карболовой кислоты или фенола (3–5 %), сулемы (0,1–0,2 %), хлорамина (1–5 %), этиловый спирт, щелочи и кислоты различной концентрации.

Для обработки сред, компоненты которых легко разлагаются при нагревании, применяют механическую стерилизацию фильтрованием через мелкопористые фильтры (свечи Шамберлана, Беркефельда, фильтр Зейтца).

Демонстрация

1.Питательные среды: основные, элективные, селективные, диф- ференциально-диагностические.

2.Бактериальные фильтры.

Основными задачами бактериологического метода являются:

1)получение чистой культуры какого – либо вида из микробной ассоциации (из внешней среды или из организма человека) и предупреждение контаминации посторонней микрофлорой исследуемого материала;

2)идентификация микробов выделенной чистой культуры;

3)определение дополнительных средств, например, чувствительности к антибиотикам, вирулентности.

В основе бактериологического исследования лежит получение чистых культур, т. е. совокупности микробов одного вида, полученных из одного образца материала и содержащихся в определенном объеме среды.

28

Выделение чистых культур бактерий состоит из 3-х этапов:

1)посев исследуемого материала на плотные питательные среды для получения изолированных колоний;

2)исследование колоний;

3)пересев с выбранных колоний на скошенный в пробирке МПА или специальную среду.

Существуют различные техники первичного исследуемого материала на питательные среды для получения изолированных колоний.

Техника посева на чашки Петри бактериологической петлей

Петлю исследуемого материала наносят на агар около края чашки и растирают на небольшом участке, затем, не отрывая петли, засевают материал на всю поверхность среды параллельными штрихами с интервалом 4–5 мм (рис. 1а). Посев можно производить и следующим способом: делается 4–5 параллельных штрихов в направлении А, затем петля прожигается в пламени горелки и ею проводятся штрихи в направлении Б поперек первоначально нанесенных полос. Петля снова прожигается, и делаются штрихи в направлении В, а затем и в направлении Г (рис. 1б). Ещё один вариант посева петлей заключается в том, что чашку со средой делят на 4–5 радиальных секторов и одной и той же петлей поочередно делают посевы на всех секторах (рис. 1в).

Г

Техника посева шпателем (метод Дригальского)

Берут 3 чашки Петри с плотной питательной средой. На середину первой петлей или пастеровской пипеткой вносят каплю исследуемого материала и круговыми движениями шпателя производят сплошной посев. Этим же шпателем, не стерилизуя его, распределяют материал по второй и третьей чашкам.

29

Техника посева тампоном

Первоначально тампоном, поворачивая его разными сторонами, проводят на чашке со средой диагональную дорожку шириной 1–2 см, затем штрихами петли через дорожку засевают среду по обе её стороны. Во втором варианте один из радиальных секторов чашки засевают тампоном, а затем поочередно остальные секторы – петлей с заходом каждый раз на уже обработанную тампоном поверхность.

Техника посева в толщу плотной среды (метод Коха)

Готовят 10-кратные разведения материала в стерильном изотоническом растворе хлористого натрия и вносят по 1 мл каждого разведения в пробирки с 9 мл расплавленного и остуженного до 45–50 °С агара. После тщательного перемешивания содержимое каждой пробирки выливают в стерильную чашку Петри. Метод применим при количественных исследованиях.

Техника посева проб исследуемого объекта (отпечатки)

Свежий срез объекта (например, кусочков органов, пищевых продуктов плотной консистенции) берут пинцетом и прикасаются к поверхности агара в соответствующем участке чашки Петри.

Задания

1.Ознакомиться с устройством и работой автоклава и сушильного шкафа.

2.Приготовить питательный мясопептонный бульон, для чего

вколбу со 100 мл дистиллированной воды поместить навеску пасты, содержащую концентрированный рыбный гидролизат, размешать, кипятить в течение 2–3 мин, определить рН (7,2–7,5), профильтровать, разлить в пробирки и простерилизовать в автоклаве.

3.Приготовить питательную среду из сухого агара, для чего всыпать

вколбу со 100 мл дистиллированной воды навеску сухого порошка, размешать, кипятить на слабом огне 1–2 мин, профильтровать, разлить по пробиркам. После автоклавирования пробирки оставить на столе

внаклонном положении для застывания агара в виде скошенной поверхности (скошенный агар).

4.Рассеять смешанную культуру на питательные среды для получения изолированных колоний, используя при этом различные техники посева.

30