Общая микробиология. Лабораторный практикум

Приготовление препарата «висячая капля»

На середину покровного стекла нанести каплю исследуемой жидкой культуры. Каплей вниз опустить покровное стекло на предметное стекло с углублением (лункой), края которого смазаны вазелином. Капля должна свободно свисать и не касаться дна краев углубления. Создается герметически закрытая камера, в которой бактерии можно наблюдать длительное время (4–6 ч). При малом увеличении найти край капли, после чего переместить ее в центр поля зрения и микроскопировать с объективом сильного увеличения и с иммерсионным объективом.

Приготовление препарата «раздавленная капля»

На середину предметного стекла нанести каплю жидкой бактериальной культуры. Осторожно накрыть её покровным стеклом, чтобы не было пузырьков воздуха, после чего микроскопировать с малым сухим, а затем с большим сухим и иммерсионным объективами.

Прижизненная окраска бактерий

Для такой окраски применяются сильно разбавленные растворы красителей, которые не оказывают токсического действия на бактерии. На предметное стекло нанести каплю 0,001 %-ного раствора метиленового синего, в которую внести взвесь бактерий, после чего приготовить препарат «раздавленная капля» и микроскопировать его.

Контрольные вопросы

1.Что является предметом изучения микробиологии?

2.Какие разделы включает микробиология?

3.Основные этапы развития микробиологии.

4.Каковы принципы таксономии микроорганизмов?

5.В чем состоит нумерическая таксономия микроорганизмов?

6.Как строится номенклатура микроорганизмов?

7.Каково назначение микробиологической лаборатории?

8.В чем состоят основные правила работы в микробиологической лаборатории?

9.Каковы методы микробиологических исследований?

10.Из каких частей состоит биологический микроскоп?

11.Как определить увеличение микроскопа?

12.Что собой представляет разрешающая способность микроскопа? От чего она зависит?

13.Какие существуют методы микроскопирования?

14.Каковы правила работы с сухими объективами?

11

15.В чем состоит принцип иммерсионной микроскопии?

16.Каковы правила иммерсионной микроскопии?

17.В чем состоит фазово-контрастная микроскопия? Ее применение.

18.С какой целью применяется темнопольная микроскопия?

19.Каков принцип люминесцентной микроскопии?

20.Вчемсостоитэлектронная микроскопия? Каковыее возможности?

21.В чем состоит принцип сканирущей-зондовой микроскопии?

22.Какие преимущества и недостатки характерны для нативных препаратов бактерий?

23.Какими методами определяют количество бактерий на единицу объема?

24.В чем состоит приготовление препарата «висячая капля»?

25.Как готовится препарат «раздавленная капля»?

26.В чем состоит прижизненная окраска бактерий?

ТЕМА 1.2. Морфология и структура бактерий. Приготовление фиксированных препаратов, простые методы окраски

Всем бактериям присущи определенная форма и размеры, которые выражаются в микрометрах. Они варьируют в широких пределах – от 0,1–0,15 мкм (Mycoplasma) до 10–15 мкм (Clostridium) в длине и от

0,1 мкм до 1,5–2,5 мкм в диаметре. Бόльшая часть бактерий имеет размеры от 0,5–0,8 мкм до 2–3 мкм.

Различают следующие основные формы бактерий: шаровидные (сферические) или кокковидные, палочковидные (цилиндрические), извитые (спиралевидные), нитевидные. Обнаружены так называемые квадратные бактерии, которые образуют скопления из 8 или 16 клеток в виде пласта.

Организация бактериальной клетки такова, что она позволяет ей координировать все процессы жизнедеятельности, за определенный срок удваивать свою биомассу и размножаться путём бинарного деления. В составе бактериальной клетки можно выделить различные структуры: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, нуклеоид, мезосому, периплазматическое пространство, цитоплазматические включения, рибосомы, капсулу, микрокапсулу, жгутик, плазмиды, пили, фимбрии, перемычки в периплазматическом пространстве.

Для изучения морфологии бактерий из них готовят фиксированные мазки. Фиксированные окрашенные препараты позволяют разграничить бактерии, выявлять детали строения микробной клетки, они удобны

12

впрактической работе, особенно при изучении патогенных микроорганизмов. Подготовка фиксированных препаратов включает приготовление мазка, высушивание его, фиксацию и окрашивание мазка.

Для приготовления мазка на чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал с плотной питательной среды и распределяют так, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1–1,5 см. При приготовлении мазков из жидких культур исследуемый материал непосредственно наносится на предметное стекло.

Высушивание мазка проводится на воздухе или в струе тёплого воздуха.

Фиксация мазка производится с целью прикрепления микроорганизмов к стеклу и обеззараживания препарата. Кроме того, фиксированные бактерии лучше воспринимают красители. Для фиксации мазков высушенный препарат проводят 3–4 раза через пламя горелки, причём в пламени препарат следует выдерживать не более 2 сек. Если фиксация проведена правильно, стекло при прикосновении к тыльной поверхности руки тотчас после окончания процесса фиксации слегка обжигает кожу. В некоторых случаях мазки можно фиксировать путем погружения в этиловый спирт на 15–20 мин, в смесь равных объёмов этилового спирта и эфира (смесь Никифорова) на 15–20 мин,

вацетон на 5 мин.

Окрашивание мазков осуществляется растворами анилиновых красителей. В основе окраски лежат сложные химические и физико – химические процессы взаимодействия компонентов микробной клетки с анилиновыми красителями. Красящая способность последних зависит от наличия у них карбоксильных, серосодержащих аминогрупп, от заряда микробной клетки. Для окраски микроорганизмов используют, главным образом, основные красители – метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый, фуксин, гематоксилин, везувин и др. Для выявления различных структурных элементов бактериальной клетки применяют нейтральные и кислые красители (нейтральный красный, кислый фуксин, Конго, пикриновая кислота и др.). Отношение микроорганизмов к красителям определяет их тинкториальные свойства.

Различают простые и сложные методы окраски. Первые состоят в окрашивании мазков одним красителем и дают возможность ознакомиться с общей морфологией микробов, их пространственным расположением на мазке и размерами клеток.

13

Задания

1.Приготовить мазки из жидкой культуры бактерий и с плотной питательной среды.

2.Окрасить мазок простым способом, для чего на фиксированный препарат нанести водный раствор фуксина (фуксин Пфейффера) на 1–2 мин или раствор метиленового синего на 3–5 мин, затем краску слить, препарат ополоснуть водой и просушить с помощью фильтровальной бумаги. Микроскопировать с иммерсионной системой и зарисовать.

3.Изучить в готовых препаратах различные формы микроорганизмов: шаровидные, палочковидные, извитые, нитевидные.

Контрольные вопросы

1.Каковы морфологические особенности бактериальной клетки?

2.Какие размеры имеют бактерии?

3.Какие этапы включает приготовлениефиксированных препаратов?

4.Фиксация, основные цели фиксации мазков. Методы фиксации.

5.Какие красители используют для окрашивания фиксированных мазков?

6.Простой метод окраски. Основное значение этого метода.

7.Техника окраски мазка простым способом.

8.Каковы преимущества исследования бактерий в живом состоянии и в фиксированных окрашенных препаратах?

ТЕМА 1.3. Морфология и структура бактерий. Приготовление фиксированных препаратов. Окраска по Граму

Клеточная стенка – структурный компонент, присущий только бактериям:

•сохраняет постоянную форму клетки;

•защищает внутреннюю часть клетки от действия механических

иосмотических сил внешней среды; участвует в регуляции роста и деления клеток;

•обеспечиваеткоммуникациюсвнешнейсредойчерезканалыипоры;

•несёт на себе специфические рецепторы для бактериофагов;

•определяет антигенную характеристику бактерий;

•содержащийся в её составе пептидогликан наделяет клетку важными иммунобиологическими свойствами.

14

Нарушение синтеза клеточной стенки бактерий является главной причиной их L-трансформации. Структура и химический состав клеточной стенки у разных бактерий не одинаков. По окраске мазков по методу Грама все бактерии дифференцируют на грамположительные и грамотрицательные, которые характеризуются отличительными особенностями (табл. 1.1).

Таблица 1.1

Особенности клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий

15

Цитоплазматическая мембрана является полифункциональной структурой. Выполняет следующие функции:

•воспринимает всю химическую информацию, поступающую в клетку из внешней среды;

•является основным осмотическим барьером, благодаря которому внутри клетки поддерживается определенное осмотическое давление;

•совместно с клеточной стенкой участвует в регуляции роста и клеточного деления бактерий;

•участвует в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид;

•в цитоплазматической мембране содержится значительное количество ферментов, в том числе системы переноса электронов;

•участвует в процессах транспорта питательных веществ в клетку

ипродуктов жизнедеятельности из клетки в окружающую среду;

•участвует в синтезе компонентов клеточной стенки и образовании мезосом;

•с цитоплазматической мембраной связаны жгутики и аппарат регуляции их движения.

Цитоплазма бактерий представляет собой сложную коллоидную систему. Она неподвижна. В цитоплазме располагаются ядерный аппарат – нуклеоид, плазмиды, рибосомы, мезосомы, различные включения.

Нуклеоид состоит из замкнутой спиральной нити ДНК. Длина нити – около 1 мм. Это одиночная бактериальная хромосома. В нуклеоиде также находятся РНК – полимераза, основные белки (но не гистоны). Бактериальная хромосома имеет видбус. Одинконец её часто связан с мезосомой.

Плазмиды – внехромосомные генетические структуры бактерий. Представляют собой замкнутую молекулу двухнитчатой ДНК, связанную с белком. Локализуются в цитоплазме клетки или в состоянии интеграции с хромосомой. Приобретение или утрата плазмид приводит к приобретению или утрате одного или нескольких признаков, хотя существуют «немые» плазмиды. Наиболее известны F-плазмида, R-фактор, Col-плазмида, Tox-плазмида.

Мезосомы– мембранные структурыбактерий, выполняющие функцию генерации энергии, аналоги митохондрий эукариот. Способны ассоциироваться с рибосомами. Представляют собой инвагинации цитоплазматической мембраны, накоторой локализованы ферменты дыхания.

Рибосомы – внутриклеточные органоиды, осуществляющие синтез белка. Состоят из белка и трех типов РНК, построены из 2 субъединиц. Бактериальные рибосомы не связаны с мембранным аппаратом, имеют константу седиментации 70S.

16

Для выявления отдельных структур бактериальной клетки существуют дифференцированные (сложные) методы окраски. В отличие от простого присложном способе окраски используют два и более красителя.

Задание

Окрасить мазок дифференцированным методом.

Техника окраски по Граму

а) на фиксированный препарат поместить полоску фильтровальной бумаги и на неё нанести раствор карболового генцианвиолета на 1–2 мин; б) краситель слить, снять фильтровальную бумагу и обработать препарат в течение 1–2 мин раствором Люголя до почерненияпрепарата; в) слить раствор Люголя и на препарат нанести несколько капель

этилового спирта на 30–60 сек; г) промыть водой и докрасить препарат водным фуксином в тече-

ние 1–2 мин; д) слить краску, промыть водой, высушить и микроскопировать

препарат с иммерсионной системой.

При данном методе одни бактерии окрашиваются в тёмно-фиолетовый цвет (грамположительные), другие – в красный или розовый (грамотрицательные). Сущность метода состоит в том, что клеточная стенка грамположительных бактерий прочно фиксирует комплекс генцианвиолет – раствор Люголя, не обесцвечивается этанолом и потому не воспринимает дополнительный краситель (фуксин). У грамотрицательных микробов комплекс легко вымывается из клетки этанолом, и они окрашиваются дополнительным красителем.

Зарисовать грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Контрольные вопросы

1.Какова структура, химический состав и функции клеточной стенки бактерий?

2.Какими отличительными особенностями характеризуются клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий?

3.Какую роль играет цитоплазматическая мембрана?

4.Каковы особенности организации ядерного аппарата бактерий?

5.Чем характеризуются плазмиды?

6.Что собой представляют цитоплазма, мезосомы и рибосомы бактерий?

7.С какими целями используют сложные методы окраски?

8.В чём заключается принцип окраски по Граму?

17

ТЕМА 1.4. Микроскопический метод исследования: морфология и структура бактерий. сложные методы окраски

У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой.

Микрокапсула выявляется при электронной микроскопии в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Капсула представляет собой слизистый слой, который обычно сохраняет связь с клеточной стенкой. Капсула служит внешним покровом бактерий, толщина её более 0,2 мкм, она чётко обнаруживается под микроскопом после негативного окрашивания. Например, по методу Бури – Гинса. Капсулы, в связи с их гелеобразной консистенцией, плохо удерживают красители, поэтому для их обнаружения наиболее приемлем метод негативного контрастирования. По химическому составу различают капсулы, состоящие из полисахаридов, содержащих азот (аминосахара); капсулы полипептидной природы.

Некоторые виды патогенных бактерий (S. pneumoniae, B. anthracis, C. perfringens и др.) образуют капсулы лишь в организме человека или животного, другие – как в организме, так и на искусственных питательных

(иногда специальных) средах (S.aureus, S.pyogenes, K.pneumoniae, K. rhinoscleromaris и др.). У патогенных бактерий капсула может окружать одну, две или целую цепочку клеток. Капсулы образуют мощную оболочку бактерий, предохраняют их от высыхания, несут для них запасные питательные вещества. Капсульные антигены патогенных бактерий определяют их антигенную специфичность и иммуногенные свойства. Нередко слизистые экзополимеры выделяются бактериальной клеткой в значительно большем количестве, частично отделяются от неё и образуют рыхлый слизистый слой.

В цитоплазме бактерий могут содержаться включения – компактные скопления химических веществ в форме видимых в световой микроскоп гранул. Представляют собой запасные питательные вещества или продукты обмена (волютин, гликоген, крахмал, жиры, сера, железо и др.). Присутствуют непостоянно. Имеют значение в идентификации. Выявляются специальными методами окраски анилиновыми красителями.

Бактерии имеют органоиды движения – жгутики. Это тонкие длинные нитевидные белковые образования диаметром 12–30 нм и длиной от 6–9 до 80 мкм. Белок, из которого построены жгутики, называется флагеллин. Он обладает сократительной способностью.

18

Жгутик состоит из однотипных спиралевидных или продольно уложенных вокруг полой сердцевины белковых субъединиц, образующих цилиндрическую структуру, которая особым образом прикреплена к бактериальной клетке. По характеру расположения жгутиков и их количеству подвижные бактерии условно делят на 4 группы:

1)монотрихи – один полярно расположенный жгутик (V. cholerae);

2)лофотрихи – пучок жгутиков на одном конце (Pseudomonas methanica);

3)амфитрихи – по одному жгутику или пучки жгутиков на обоих концах клетки (Spirillum volutans);

4)перитрихи – множество жгутиков, расположенных вокруг клет-

ки (E. coli, Salmonella typhi).

Жгутики выявляются прямым путем с помощью специальной окраски (с использованием протравы, которая вызывает набухание жгутиков) или косвенно по движению в капле суспензии, регистрируемому в темнопольном, фазово-контрастном и световом микроскопах, по диффузному помутнению полужидких сред или серологически по наличию жгутикового антигена (H-антиген).

На поверхности некоторых бактерий располагаются реснички (пили). Это небольшие трубочки, по внешнему виду напоминающие жгутики, но

вотличие от них тоньше, короче, имеют канал. Встречаются у грамотрицательных бактерий. Различают: половые секс-пили (F-пили) и вегетативные – фимбрии. Секс-пили – нитевидные структуры белковой природы (длина 0,5–10 мкм), которые образуются под контролем F- плазмиды (F-пили) или Col-фактора (i-пили). Возникают на поверхности бактерий в процессе конъюгации и выполняют функцию органелл, через которые плазмидная ДНК переходит от донора к реципиенту. Количество плазмид (1–2 на клетку).

Фимбрии – трубчатые образования, исходящие из цитоплазмы. Их синтез контролируется бактериальной хромосомой. Общий диаметр фимбрий равен 3–25 нм, внутренний диаметр канала – около 2 нм. Одна бактерия может содержать сотни фимбрий, расположенных или на боковых поверхностях бактерии, например, у кишечной палочки, или на

полюсах, например, у псевдомонад. Фимбрии принимают участие в слипании бактерий в агломераты, в их прилипании к различным поверхностям, в питании, поддержании осмотического давления. Выявляют агглютинацией эритроцитов и иммунными реакциями. Могут быть обнаружены лишь при электронной микроскопии.

19

Некоторые бактерии при неблагоприятных для существования условиях образуют защитные формы – споры. Спорообразование характерно для бактерий родов Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Desulfatomaculum и актиномицетов рода Thermoactinomyces. Спора, образующаяся внутри цитоплазмы бактериальной клетки, может иметь округлую или овальную форму. Она может располагаться в центре (центральное расположение у С.perfringens), на конце (терминальное расположение у C.tetani) или ближе к одному из концов (субтерминальное расположение у C.botulinum). Спора отличается от вегетативной формы репрессией генома, почти полным отсутствием обмена веществ, малым количеством свободной воды в цитоплазме, повышением в ней концентрации ионов кальция и появлением дипиколиновой кислоты, с которыми связывают термоустойчивость споры.

Задания

1. Выявление капсул по методу Бурри – Гинса.

а) на край предметного стекла нанести каплю туши, а рядом каплю исследуемой культуры. Капли быстро перемешать и с помощью шлифованного стекла приготовить тонкий мазок;

б) после высушивания мазок фиксировать над пламенем и окрасить фуксином в течение 1–2 мин;

в) осторожно промыть водой и высушить. Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсула не окрашивается и имеет вид светлой зоны вокруг бактерий на тёмном фоне;

г) микроскопировать препарат.

2. Окраска включений волютина по методу Нейссера.

Приготовить мазок и окрасить по методу Нейссера для выявления зёрен волютина, микроскопировать.

а) фиксированный мазок окрасить в течение 2–3 мин уксуснокислой синькой Нейссера;

б) препарат 10–30 сек обрабатывать раствором Люголя; в) не промывая водой, мазок докрасить в течение 30–60 сек везу-

вином.

Зёрна везувина окрашиваются в синий цвет, тела клеток в жёлтый. Микроскопировать препарат, приготовленный по методу Леффлера.

20